铁皮石斛组培体系的建立

郑子首,孙晨瑜,吕晓倩,侯文秋,李 滨

山东农业大学 生命科学学院,山东 泰安 271018

铁皮石斛组培体系的建立

郑子首,孙晨瑜,吕晓倩,侯文秋,李 滨*

山东农业大学 生命科学学院,山东 泰安 271018

铁皮石斛作为一种重要的抗癌抑癌药物，在全民养生的今天越来越多的成为了人们消费的热点。然而，由于野生的铁皮石斛非常稀少而且非常昂贵，不适合大众消费。所以建立一套适合工业化生产的组培体系成为了发展的趋势。以幼嫩的铁皮石斛带节茎段为原材料，1/2MS作为培养基，探究了不同激素浓度及其他因素对铁皮石斛快繁和组培的影响。再以组培出的幼苗为原材料，研究了温度、水质、培养基质及浇水方式等对铁皮石斛炼苗的影响。结果表明，铁皮石斛快繁的最佳激素浓度为6-BA,1.0 mg/L和NAA，1.0 mg/L，及1%的活性炭，诱导率为12.5%；组培的最佳激素浓度为6-BA,1.5 mg/L及NAA,2.0 mg/L或6-BA,0.5 mg/L,NAA,0.5 mg/L和2,4-D,1.5 mg/L，诱导率都在80%以上。铁皮石斛的最优炼苗条件为25℃，光照过的自来水浇灌；最适合的培养基质为水苔+直径约为0.5～1.0 cm的树皮。

铁皮石斛;组培

铁皮石斛(Dendrobium officinaleKimura et Migo)是一种名贵的中药材，在民间，被誉为“救命仙草”，具有抗癌、防癌、抗辐射、抗衰老，提高人体免疫力、扩张血管、抗血小板凝结等多种功能。但铁皮石斛自然结实率很低，仅为0.31%。目前全国野生的铁皮石斛越来越少，已不足500 kg，全国市场上每年流通的正宗野生铁皮枫斗不到数十公斤，而早在87年就被国家列为野生药材重点二级保护濒危植物。

今年来，铁皮石斛在组培快繁方面取得了部分的进展，国内外的研究内容涉及了培养基选择[1-3]、外植体选择[4-7]、激素配比[5-6,8-10]等诸多方面。然而，对于天然添加物的种类、浓度、添加时机等方面的结论差异较大。李筑等[2]对石斛炼苗的基质进行了详细的研究，但还有水源等几个方面没有考虑到，有进一步研究的价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组培原料 选用纯种的生长状况均一的铁皮石斛为快繁和组培的原料。

1.1.2 炼苗原料 组培获得的生长状况相同的幼苗。基质：Ⅰ直径大约为0.5～1 cm的树皮。Ⅱ直径大约为0.5～1 cm树皮+直径大约为1 cm的砖头。Ⅲ水苔+直径大约为0.5～1 cm的树皮。Ⅳ腐殖土。Ⅴ腐殖土和少量珍珠岩配成的混合基质。

1.2 方法

1.2.1 快繁 Ⅰ外植体消毒:选取生长旺盛无病害的粗壮植株茎段，每一节为一段，剥去茎表皮，用去离子水洗净，放入超净工作台中。用75%酒精消毒30 s，用5%的NaClO消毒8 min，最后用去离子水洗净，切去边缘。Ⅱ外植体的培养:将处理过的茎段接入1/2的MS+3%的蔗糖+0.1%的活性炭的培养基中，用不同激素进行处理。然后将其放入光照培养箱中培养70 d左右。

1.2.2 组培 Ⅰ外植体消毒：方法同上。Ⅱ愈伤组织的形成：将横切过的铁皮石斛带节茎段放入不同激素的1/2MS+3%蔗糖的固体培养基中并用不同激素进行处理。Ⅲ当诱导分化出的不定芽长到大约3 cm时，将不定芽沿根部的愈伤组织切下，并转移到最佳生根培养基中，诱导其分化成不定根。本文着重研究不同激素处理对铁皮石斛脱分化形成不定芽的影响。

1.2.3 炼苗 Ⅰ原材料的选取:从组培苗中选取生长状况相近，茎秆健壮，高度相差较小的铁皮石斛组培苗若干，洗净根部的培养基，并消毒备用。Ⅱ培养基质的配置:购买实验所需的各种土壤基质，配制成以下几种培养基质：①直径约为0.5～1 cm的树皮。②直径约为0.5～1 cm树皮+直径约为1 cm的砖头。③水苔+直径约为0.5～1 cm的树皮。④腐殖土。⑤腐殖土+少量珍珠岩配成的混合基质。（以下称①、②、③、④、⑤）Ⅲ分组对照：按照温度、培养基质、水源的不同将选取的铁皮石斛组培苗平均分成大小株数相近的30组，并设置一组重复组作为对照，培养观察，并进行记录。

2 结果与分析

2.1 不同激素处理对铁皮石斛的快繁的影响

野生石斛体内存在大量的内生共生菌，普通灭菌方法难以根除，加入活性炭后能够显著降低铁皮石斛的染菌率。用不同浓度的激素（表1）进行处理后得出外植体在培养30 d左右就可以明显发现石斛腋芽的出现，60 d石斛幼苗几乎发育完全，可以进行炼苗。经实验证明，铁皮石斛茎段在（1）条件下诱导率最高，为12.5%，(2)、(3)分别为11.2%和5.0%。结果表明，铁皮石斛快繁最佳培养基为1/2MS培养基+1.0 mg/L的6-BA，3%的蔗糖+0.1%的活性炭，并对外植体进行切割处理。（图1）

表1 铁皮石斛快繁不同激素处理Table 1 Different phytohormone in micropropagation rapid propagation ofDendrobium officinaleKimura et Migo

图1 铁皮石斛快繁Fig.1The result of micro-propagation rapid propagation ofDendrobium officinaleKimura et Migo

2.2 不同激素处理对铁皮石斛的组培的影响

用不同浓度的激素（表2）对铁皮石斛大量进行处理，最终获得了几组诱导率很高的浓度配比。其中，诱导率最高的是1.5 mg/L的6-BA和2.0 mg/L的NAA，其诱导率为96%，其次是0.5 mg/L的6-BA，0.5 mg/L的NAA和1.5 mg/L的2，4-D，其诱导率是大约83%。其他浓度诱导率都在50%以下。因为加入活性炭具有良好的抑菌效果，因此在组培过程中依旧保存着0.1%的活性炭。（愈伤组织见图2）

表2 铁皮石斛组培不同激素处理Table 2 Different phytohormone in tissue culture ofDendrobium officinaleKimura et Migo

图2 铁皮石斛愈伤组织Fig.2 The callus ofDendrobium officinaleKimura et Migo

2.3 铁皮石斛的炼苗

经预实验发现一次性浇透水过后，3天之后基质干透，需再次浇水，为防止水分过多烂根，水分较少根部枯萎，浇水周期定为3天。每隔十天观察记录一次现象，大约3个月之后，对数据进行生物统计学统计，统计出组培苗的成活率和幼苗的生长速率，可得出最适宜石斛炼苗的条件和对其影响最大的外界因素，从而实现对铁皮石斛进行的生产培育工作。通过对铁皮石斛的温度、培养基质、水源等影响因素进行分组处理（表3、4），经一年的观察，以及对出芽时间和数量的记录，得出了铁皮石斛炼苗最快恢复（以分化出第一芽的时间为依据）的培养条件为30℃，⑤号培养基质并用光照过的自来水浇灌，第一芽分化的时间只有10 d。但这种条件对于铁皮石斛日后生长不利，极易会出现枯死、烂根等情况。后期有利于铁皮石斛生长（以植株长势及最后出芽总数为依据）的培养条件是25℃，③号培养基质。水质方面，自来水与光照过的自来水效果差不多，但均优于去离子水。在此条件下幼苗全部存活并且长势良好，浇水次数方便人工管理，适合大面积炼苗（图3）。

表3 30℃时的实验处理Table 3 The number cultivated in 30℃

表4 25℃时的实验处理Table 4 The number cultivated in 25℃

图3 铁皮石斛炼苗情况Fig.3 The conditions of hardening-seedlings ofDendrobium officinaleKimura et Migo

3 讨论

铁皮石斛属于药用价值极高的产品。在快速生长的过程中，会造成药用成分质量的下降。下一步的研究方向应该是改良培养基的配方以及培养环境来降低或防止此现象。如果要实现大批量的生产，培养基的成本也是亟待解决的方面，优化培养基的配方，使其物美价廉。

另外在炼苗过程中，建议先使用135的条件进行培养，出芽后立即转移到233的条件中。

[1]宋 顺,许 奕,王必尊,等.不同培养基成分对铁皮石斛组织培养的影响[J].中国农学通报,2013,29(13):133-139

[2]李 筑.铁皮石斛炼苗基质的筛选研究[J].中国民间医药,2015,2(2):27-28

[3]崔现亮.铁皮石斛生根壮苗培养基及炼苗技术研究[J].现代农业科技,2015,1(1):104-108

[4]陈 希,黄丹丹.铁皮石斛的组织培养与快速繁殖研究进展[J].海峡药学,2011,23(8):19-22

[5]温明霞,聂振朋,林 媚,等.铁皮石斛组织培养与快速繁殖研究进展[J].广西农业科学,2007,28(3):227-230

[6]宋 顺,许 奕,李敬阳,等.铁皮石斛的组织培养与快速繁殖研究进展[J].中国农学通报,2013,29(33):286-290

[7]远凌威.三个产地铁皮石斛组织培养及其抗寒生理研究[D].信阳:信阳师范学院,201

[8]王 聪.铁皮石斛快速繁殖技术研究[D].广州:仲恺农业工程学院,2014

[9]翟明恬,刘红霞,王亚妮.铁皮石斛组织快繁及移栽培养[J].东北林业大学学报,2015,43(1):50-53,71

[10]黄 勇.铁皮石斛组织培养技术研究进展[J].文山学院学报,2013,26(6):14-19

TissueCultureSystemEstablishmentofDendrobiumofficinaleKimuraetMigo

ZHENG Zi-shou,SUN Chen-yu,LV Xiao-qian,HOU Wen-qiu,LI Bin*
College of Life Sciences/Shandong Agricultural University,Tai’an271018,China

As an important medicine for anticancer,Dendrobium officinaleKimura et Migo becomes a hot topic during the health-preserving society.WildDendrobium officinaleis very rare and very expensive and not suitable for public consumption.So the establishment of the tissue culture system suitable for industrial production has become the tendency.We used its stalk as material and 1/2 MS as basal culture medium,investigated the effects of different hormone concentration and other factors on the tissue culture ofD.Officinale,and then used these plants cultivated as material to explore the effects of temperature,water quality,culture medium and watering method on the seedling ofDendrobium officinale.The results showed that the best medium of rapid multiplication was basal culture medium+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/LNAA+1%PAC,and it’s inductivity was 12.5%.The best medium of tissue culture was basal culture medium+1.5 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA or 0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA or 0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L 2,4-D,and their inductivities were all over 80%.The best conditions to hardening-seedlings was 25℃+lighted tap wate,the most suitable culture medium was sphagna+0.5～1.0 cm barks in diameter.

Dendrobium officinaleKimura et Migo;tissue culture

S567.239;Q813.1

A

1000-2324(2017)04-0537-03

2016-04-12

2016-04-10

郑子首(1996-),男,本科生.E-mail:775618761@qq.com

*通讯作者:Author for correspondence.E-mail:agribiolab@163.com