人巨细胞病毒微小RNA miR-US4-5p靶向抑制PAK2的表达

邵耀中,齐 莹,郭 鑫,蒋树娟,黄郁晶,柳中洋,阮 强,解立怡

(西安交通大学第一附属医院肾脏内科,陕西 西安 710061;*通讯作者,E-mail:275573101@qq.com)

人巨细胞病毒微小RNA miR-US4-5p靶向抑制PAK2的表达

邵耀中,齐 莹,郭 鑫,蒋树娟,黄郁晶,柳中洋,阮 强,解立怡*

(西安交通大学第一附属医院肾脏内科,陕西 西安 710061;*通讯作者,E-mail:275573101@qq.com)

目的 寻找人巨细胞病毒微小RNA miR-US4-5p调控的靶mRNA,检测miR-US4-5p对靶mRNA PAK2蛋白质表达的调节作用。 方法 采用Hybrid-PCR方法及Targetscan软件分析从人巨细胞病毒感染的人胚肺成纤维细胞总RNA中筛选候选靶mRNA;应用荧光素酶实验,通过构建PMIR-PAK2报告基因,将其和miR-US4-5p、miRNA阴性对照共转染到HEK293细胞中,验证miR-US4-5p与候选靶mRNA的结合能力;应用Western blot方法,通过将miR-US4-5p、miRNA阴性对照分别转染到HEK293细胞、HELF细胞、THP-1细胞中,验证转染miR-US4-5p对靶mRNA蛋白质表达的调节作用。 结果 通过Hybrid-PCR方法及Targetscan筛选出12个miR-US4-5p的待选靶mRNA;荧光素酶实验表明:与转染miRNA阴性对照相比,转染miR-US4-5p可以显著地下调PMIR-PAK2的荧光素酶活性,从而验证了miR-US4-5p与PAK2的结合性,在HEK293细胞、HELF、THP-1细胞中PAK2可以被过表达的miR-US4-5p造成不同程度的下调。 结论 人巨细胞病毒表达的miR-US4-5p在三种不同细胞系中具备抑制PAK2蛋白质表达的能力。

人巨细胞病毒; 微小RNAs; p21激活激酶

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)是一种普遍存在的β-疱疹病毒。在免疫力低下的患者中,有较高的发病率和死亡率[1]。人巨细胞病毒具有230 kb的基因组,编码来自16个前体的至少26个成熟miRNA[2]。miRNA对它们靶mRNA的转录后调控被认为是通过miRNA 5′末端的2-7个核苷酸(被称为种子区)和位于mRNA 3′非编码区的结合位点之间的结合来实现。这种结合导致所涉及的靶mRNA的翻译抑制和降解[3]。越来越多的证据表明,病毒的miRNA可与免疫逃避、潜伏感染及细胞凋亡相关[4-6]。作为一个从人巨细胞病毒miR-US4前体来源的miRNA,人巨细胞病毒的miR-US4-5p是从HCMV感染的人胚肺成纤维细胞(HELF)小RNA的深度测序分析中首次鉴定的[7]。然而,它的功能目前还不清楚。

因此,基于miRNA在病毒和宿主生物学功能中所发挥的巨大作用,本研究通过Hybrid-PCR的方法筛选人巨细胞病毒miR-US4-5p的待选靶基因,通过荧光素酶试验对待选靶基因进一步验证,并应用Western blot的方法在多种细胞系中验证miR-US4-5p对待选靶基因蛋白表达的影响。这对进一步研究miR-US4-5p对宿主疾病发生的机制、探究其生物学功能均具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 病毒株、细胞株

实验所用的HCMV Han株是本实验室保存的临床分离株。人胚肺成纤维细胞(HELF)、人胚肾293细胞(HEK293)、人外周血单核细胞THP-1来自于中国科学院上海细胞所。

1.2 感受态细菌、质粒、抗体

Top10感受态细菌购自北京天根生化科技有限公司;使用含15%胎牛血清的MEM培养HELF。使用含10%胎牛血清的DMEM培养HEK293细胞。使用含10%胎牛血清的1640培养THP-1细胞。PCR2.1载体购自Invitrogen公司(美国);荧光素酶报告质粒购自Applied Biosystems公司(美国);荧光素酶活性检测试剂购自Promega公司(美国);蛋白质提取和检测试剂购自Thermo公司(美国);抗体购自Abcam公司(美国);PCR试剂、限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自TakaRa公司(中国);、miR-US4-5p的成熟体、抑制剂及阴性对照成熟体购自RiboBio公司(中国)。

1.3 hybrid-PCR和Targetscan软件预测筛选miR-US4-5p的候选靶mRNA

Hybrid PCR是快速有效筛选任意miRNA候选靶mRNA的方法[8]。Hybrid PCR基于3′-Full RACE的实验方法,根据miRNA序列(5′-UGGACGUGCAGGGGGAUGUCUG-3′)设计miR-US4-5p的杂交引物(5′-CRGRCRTCCCCCTGCRCGTCCR-3′)。以HCMV感染细胞的晚期(L)总RNA为模板,使用miR-US4-5p的杂交引物与oligo dT的通用内外引物,进行半巢式扩增,得到候选靶基因的信息池。具体操作步骤如下:培养HELF,密度为100%时接种HCMV Han株。在接毒后72 h,用Trizol法提取HCMV感染晚期总RNA。用TaKaRa公司的3’Full RACE试剂盒中的oligo dT引物及逆转录酶将mRNA反转录成cDNA。设计并使用miR-US4-5p的杂交引物作为上游引物,oligo dT引入的通用引物“ACCGTCGTTCCACTAGTGATTT”作为下游引物,以cDNA为模板进行PCR扩增,引物由上海invitrogen公司合成。PCR产物经过纯化后(A9280,Promega,美国),用TA克隆的办法连接到PCR2.1载体(TakaRa,中国)。将连接产物转化到感受态细菌中,随机挑取阳性克隆进行DNA测序。测序结果经过NCBI的blast软件比对得到同源的mRNA序列,作为待选的靶mRNA(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)。同时也使用Targetscan(http://www.targetscan.org/)在线进行miR-US4-5p靶基因的预测。选取这两个靶基因库的交集。

1.4 荧光素酶实验验证miR-US4-5p与候选PAK2 mRNA的结合能力

用逆转录PCR方法扩增PAK2 mRNA与miR-US4-5p结合位点附近300-500 bp的序列。在扩增引物的5′末端分别加入了SpeⅠ和HindⅢ酶切位点序列。纯化PCR产物,进行SpeⅠ和HindⅢ双酶切。将酶切产物连接到pMIR report载体上荧光素酶基因的3′非翻译区(3′UTR区)的相应位点,得到“pMIR-PAK2”表达载体。培养HEK293细胞,采用lip3000共转染pMIR-PAK2、海肾荧光素酶质粒(TK)以及miR-US4-5p的成熟体(锐博公司,广州)到HEK293细胞。每个候选靶mRNA做3个复孔。用线虫的一种非特异性靶向miRNA作为阴性对照。用pMIR空载体作为系统误差对照。贴壁细胞通过裂解释放荧光素酶(Dual-Luciferase® Reporter Assay E1960,promega,美国),进行荧光素酶活性检测(LB9507,Berthhold Technologies,德国)。先检测每一样本的萤火虫荧光素酶荧光强度,后检测海肾荧光素酶荧光强度。用“萤火虫荧光素酶荧光值/海肾荧光素酶荧光值”得到消除了组内转染误差的终数据。以每个样本的3个复孔所测终数据的平均值进行对比分析。

1.5 Western blot实验分析miR-US4-5p对PAK2蛋白质表达的调控作用

通过Western blot实验,分析不同细胞系中过表达miR-US4-5p对PAK2蛋白质表达是否有下调作用。将miR-US4-5p成熟体转染至HEK293、HELF、THP-1细胞中,分为阴性对照组和转染miR-US4-5p成熟体组。用线虫的一种非特异性靶向miRNA成熟体作为微小RNA阴性对照,使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为组内对照消除转染误差。转染24 h后收集蛋白质(M-PER®Mammalian Protein Extraction Reagent, PIERCE,美国)进行Western blot检测。依次使用兔源多克隆抗体(Abcam公司,英国)和山羊抗兔的二抗(中杉金桥公司,北京)进行反应。使用ChemiDocTMMP System(Biorad,美国)进行成像,使用仪器配套软件image lab进行实验结果灰度分析处理。

2 结果

2.1 Hybrid-PCR及Targetscan筛选结果

从19个hybrid-PCR克隆中获得了4个cDNA序列(见表1)。同时通过Targetscan (http://www.targetscan.org/)预测了9个待选靶基因(见表2)。所有靶基因均来自人基因组。PAK2是唯一同时存在于两种预测方式中的靶基因。通过生物信息学软件RNAhybrid (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/submission.html)绘制了miR-US4-5p与PAK2 3'-UTR方向互补示意图,并得出最小解离自由能为-33.7 kcal/mol(见图1)。这些靶基因涉及到细胞凋亡、HCMV感染与复制、细胞能量代谢、生物大分子合成等方面。

表1 Hybrid-PCR筛选获得的HCMV miR-US4-5p候选靶mRNAs

Table 1 Putative targets of hcmv-miR-US4-5p identified by hybrid-PCR

mRNAnamesAccessionNo.Homosapiensmortalityfactor4like2(MORF4L2)NM-001142426HomosapiensRNAbindingprotein,fox-1homolog(C.elegans)2(RBFOX2)NM-001082577HomosapiensnuclearfactorI/X(CCAAT-bindingtranscriptionfactor)(NFIX)NM-002501Homosapiensp21protein(Cdc42/Rac)-activatedkinase2(PAK2)NM-002577

表2 Targetscan软件预测获得的HCMV miR-US4-5p候选靶mRNAs

Table 2 Putative targets of hcmv-miR-US4-5p predicted by Targetscan(http://www.targetscan.org/)

mRNAnamesAccessionNo.HomosapiensKCNE1-like(KCNE1L)NM-012282Homosapiensp21protein(Cdc42/Rac)-activatedkinase2(PAK2)NM-002577HomosapiensXK,Kellbloodgroupcomplexsubunit-relatedfamily,member5(XKR5)NM-001289973Homosapiensmembraneassociatedguanylatekinase,WWandPDZdomaincontaining2(MA-GI2)NM-001301128HomosapiensSp6transcriptionfactor(SP6)NM-199262Homosapienscalmodulin1(phosphorylasekinase,delta)(CALM1)NM-006888Homosapiensneuro-oncologicalventralantigen1(NOVA1)NM-002515Homosapiensproteinphosphatase3(formerly2B),regulatorysubunitB,alphaisoform(PPP3R1)NM-000945Homosapienszincfinger,BED-typecontaining4(ZBED4)NM-014838

将终止密码子后的第一个碱基位置定义为“1”,预测的miR-US4-5p种子区与PAK2的结合位点在PAK2 3′非编码区2240-2246的位置,其最小解离自由能为-33.7 kCal/mol图1 PAK2 3′-UTR与miR-US4-5p结合靶位点示意图Figure 1 A schematic diagram of predicted binding site of miR-US4-5p in the PAK2 3′UTR

2.2 荧光素酶实验检测结果

将PAK2 3′-UTR构建到pMIR-REPORTERTMLuciferase载体,转染HEK293后,通过双荧光素酶检测系统检测miR-US4-5p对PAK2 3′-UTR的调控作用。荧光素酶活性分析结果显示,与miRNA的阴性对照相比较,miR-US4-5p组PAK2 3′-UTR的荧光值显著降低(P<0.05,见图2), miR-US4-5p可以下调构建有PAK2 3′非编码区的PMIR质粒(PMIR-PAK2)约50%的荧光素酶活性。

与miRNA阴性对照比较，*P<0.05图2 验证miR-US4-5p靶向PAK2 mRNA的荧光素酶实验检测结果Figure 2 Result of Luciferase assay to validate miR-US4-5p targets at PAK2

2.3 从蛋白水平验证miR-US4-5p靶向下调PAK2表达的Western blot结果

Western blot检测了miR-US4-5p对PAK2蛋白表达水平的影响，结果发现,PAK2 siRNA有效地抑制了3种不同细胞系内源表达的PAK2蛋白表达水平。与之相似,3种不同细胞系内源表达的PAK2蛋白表达水平同时也被miR-US4-5p不同程度下调(见图3)。

3 讨论

随着HCMV编码的miRNA的发现[7,9-11],关于这些miRNAs的生物学功能逐渐被研究,包括miR-UL112-1[5,12-14]、miR-US25-1[14,15]、miR-US25-2-3p[16]、miR-UL36[17]、miR-UL70-3p以及miR-UL148D[2,18]。诸多证据表明,HCMV利用自身编码的miRNAs来调节自身及宿主细胞的基因差异表达进一步完成免疫逃避、细胞进程调节、病毒DNA复制以及对细胞凋亡的调节。

PAK2即p21活化激酶,是一个广泛存在于所有组织和细胞系中的62 kDa大小的蛋白。一些研究表明,不像PAK1,PAK2在细胞程序性凋亡,在不同的背景下发挥着双重的作用。碳末端催化的36 kDa大小的PAK2片段(PAK2p34)是从PAK2裂解衍生/活化而来,与Fas和神经酰胺诱导的Jurkat细胞凋亡,TNF-α诱导的MCF-7细胞凋亡和紫外线诱导的A431细胞的凋亡相关[19,20],这表明裂解衍生/活化的PAK2具有促凋亡功能。除了裂解衍生/活化的PAK2p34具有的促凋亡功能,全长的PAK2具有抗凋亡功能。体外表达持续活性PAK2-T402E,其模仿活化全长PAK2,似乎消除了PAK2p34对肿瘤坏死因子α,生长因子的撤出以及紫外线对于BALB3T3成纤维细胞的促凋亡作用。其机制似乎是对促细胞凋亡Bcl-2家族蛋白Bad的磷酸化以及调节应激诱导的ERK,JNK和p38途径[21]。此外,这种观点被最近的观察所支持,在用紫杉醇刺激的SKOV3-TR30细胞中过表达miR-134通过下调PAK2表达表现出了促凋亡的作用。这可能与把Bad磷酸化为Bad-112和Bad-136有关[22]。

1.negative control；2.hcmv-miR-US4-5P；与阴性对照比较，*P<0.05图3 miR-US4-5p对三种细胞中PAK2蛋白表达的影响的免疫印迹结果Figure 3 PAK2 expression in three kinds of cells after treated with miR-US4-5p by Western blot

HCMV包含了许多抗凋亡的基因,如US28,US4,UL37,UL38和UL144[23-28]。另外,越来越多的研究表明,HCMV编码的miRNA可以调节细胞凋亡。hcmv-miR-UL148D和hcmv-miR-UL36-5p被报道在感染细胞中有抑制凋亡的能力[18,29]。hcmv-miR-US25-1可以促进由氧化低密度脂蛋白所介导的内皮细胞的凋亡[30]。在本研究中,过表达miR-US4-5p可以下调多种细胞系中PAK2的表达,因此推测miR-US4-5p在自然感染状态下的后期阶段可以通过抑制PAK2表达发挥促凋亡作用,从而达到相应的生物学效应,例如促进病毒释放。尽管如此,细胞凋亡受到很多因子调节,例如BAD、TRAIL、NF-κb、Bcl-2和Bax。尽管过表达miR-US4-5p表现出抑制PAK2表达,但是这个对凋亡的确切作用还需要进一步的研究。可以假定,在和其他的促凋亡的HCMV的基因和miRNA一起的作用下,miR-US4-5p可能在调节自然感染状态下细胞凋亡并在感染晚期宿主细胞和病毒之间建立平衡发挥着作用。

[1] Kesson AM, Kakakios A.Immunocompromised children: conditions and infectious agents[J]. Paediatr Respir Rev, 2007, 8:231-239.

[2] Babu SG, Pandeya A, Verma N,etal.Role of HCMV miR-UL70-3p and miR-UL148D in overcoming the cellular apoptosis[J]. Mol Cell Biochem, 2014, 393: 89-98.

[3] Fabian MR, Sonenberg N, Filipowicz W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs[J]. Ann Rev Biochem, 2010, 79: 351-379.

[4] Cullen BR. Viral and cellular messenger RNA targets of viral microRNAs[J]. Nature, 2009, 457: 421-425.

[5] Huang T, Cui Y, Zhang X.Involvement of viral microRNA in the regulation of antiviral apoptosis in shrimp[J]. J Virol, 2014, 88: 2544-2554.

[6] Skalsky RL, Cullen BR. Viruses, microRNAs, and host interactions[J]. Ann Revi Microbiol, 2010, 64: 123-141.

[7] Stark TJ, Arnold JD, Spector DH,etal. High-resolution profiling and analysis of viral and host small RNAs during human cytomegalovirus infection[J]. J Virol, 2012, 86:226-235.

[8] Huang Y, Qi Y, Ruan Q,etal. A rapid method to screen putative mRNA targets of any known microRNA[J]. Virol J, 2011, 8: 8.

[9] Dunn W, Trang P, Zhong Q,etal. Human cytomegalovirus expresses novel microRNAs during productive viral infection[J]. Cell Microbiol, 2005, 7:1684-1695.

[10] Grey F, Antoniewicz A, Allen E,etal. Identification and characterization of human cytomegalovirus-encoded microRNAs[J]. J Virol, 2005, 79:12095-12099.

[11] Pfeffer S, Sewer A, Lagos-Quintana M,etal. Identification of microRNAs of the herpesvirus family[J]. Nature Methods, 2005, 2:269-276.

[12] Huang Y, Qi Y, Ma Y,etal. The expression of interleukin-32 is activated by human cytomegalovirus infection and down regulated by hcmv-miR-UL112-1[J]. Virol J, 2013, 10:51.

[13] Stern-Ginossar N, Elefant N, Zimmermann A,etal. Host immune system gene targeting by a viral miRNA[J]. Science, 2007, 317:376-381.

[14] Stern-Ginossar N, Saleh N, Goldberg MD,etal. Analysis of human cytomegalovirus-encoded microRNA activity during infection[J]. J Virol, 2009, 83:10684-10693.

[15] Grey F, Tirabassi R, Meyers H,etal. A viral microRNA down-regulates multiple cell cycle genes through mRNA 5′UTRs[J]. PLoS Pathog, 2010, 6:e1000967.

[16] Qi M, Qi Y, Ma Y,etal. Over-expression of human cytomegalovirus miR-US25-2-3p downregulates eIF4A1 and inhibits HCMV replication[J]. FEBS Lett, 2013, 587:2266-2271.

[17] Huang Y, Qi Y, Ma Y,etal. Down-regulation of human cytomegalovirus UL138, a novel latency-associated determinant, by hcmv-miR-UL36[J]. J Biosci, 2013, 38:479-485.

[18] Wang YP, Qi Y, Huang YJ,etal. Identification of immediate early gene X-1 as a cellular target gene of hcmv-mir-UL148D[J]. Int JMol Med, 2013,31:959-966.

[19] Rudel T, Bokoch GM. Membrane and morphological changes in apoptotic cells regulated by caspase-mediated activation of PAK2[J]. Science, 1997, 276:1571-1574.

[20] Tang TK, Chang WC, Chan WH,etal. Proteolytic cleavage and activation of PAK2 during UV irradiation-induced apoptosis in A431 cells[J]. J Cell Biochem, 1998, 70:442-454.

[21] Jakobi R, Moertl E, Koeppel MA. p21-activated Protein Kinase-PAK Suppresses Programmed Cell Death of BALB3T3 Fibroblasts[J]. J Biol Chem, 2001, 276:16624-16634.

[22] Shuang T, Wang M, Shi C,etal. Down-regulated expression of miR-134 contributes to paclitaxel resistance in human ovarian cancer cells[J]. FEBS Lett, 2015, 589:3154-3164.

[23] Arnoult D, Bartle LM, Skaletskaya A,etal. Cytomegalovirus cell death suppressor vMIA blocks Bax-but not Bak-mediated apoptosis by binding and sequestering Bax at mitochondria[J]. ProcNatl Acad Sci US A, 2004, 101: 7988-7993.

[24] Goldmacher VS, Bartle LM, Skaletskaya A,etal. A cytomegalovirus-encoded mitochondria-localized inhibitor of apoptosis structurally unrelated to Bcl-2[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96: 12536-12541.

[25] Pleskoff O, Casarosa P, Verneuil L,etal. The human cytomegalovirus-encoded chemokine receptor US28 induces caspase-dependent apoptosis[J]. FEBS J, 2005, 272: 4163-4177.

[26] Skaletskaya A, Bartle LM, Chittenden T,etal. A cytomegalovirus-encoded inhibitor of apoptosis that suppresses caspase-8 activation[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001. 98(14): 7829-7834.

[27] Smith W, Tomasec P, Aicheler R,etal. Human cytomegalovirus glycoprotein UL141 targets the TRAIL death receptors to thwart host innate antiviral defenses[J]. Cell Host Microbe, 2013, 13(3): 324-335.

[28] Terhune S, Torigoi E, Moorman N,etal. Human cytomegalovirus UL38 protein blocks apoptosis[J]. J Virol, 2007, 81(7): 3109-3123.

[29] Guo X, Huang Y, Qi Y,etal. Human cytomegalovirus miR-UL36-5p inhibits apoptosis via downregulation of adenine nucleotide translocator 3 in cultured cells[J]. Arch Virol, 2015, 160(10): 2483-2490.

[30] Fan J, Zhang W, Liu Q. Human cytomegalovirus-encoded miR-US25-1 aggravates the oxidised low density lipoprotein-induced apoptosis of endothelial cells[J]. Biomed Res Int, 2014, 2014: 531979.

Human cytomegalovirus miRNA miR-US4-5p inhibits expression of PAK2

SHAO Yaozhong,QI Ying,GUO Xin,JIANG Shujuan,HUANG Yujing,LIU Zhongyang, RUAN Qiang,XIE Liyi*

(DepartmentofNephrology,FirstAffiliatedHospital,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China;*Correspondingauthor,E-mail:275573101@qq.com)

ObjectiveTo find the target message RNAs(mRNA) of human cytomegalovirus(HCMV) microRNA(miRNA) miR-US4-5p, and to explore the effects of miR-US4-5p on protein expression of the target mRNA PAK2.MethodsHybrid-PCR and Targetscan were used to screen the candidate target mRNAs in the pool of human embryo lung fibroblast(HELF) total RNAs. Luciferase report assay was used to validate the specific banding of miR-US4-5p to PAK2 mRNA after PMIR-PAK2 was constructed and contransfected with miR-US4-5p and miRNA negative control to HEK293 cells. Western blot was used to validate the regulation effects of miR-US4-5p on the protein expression of target mRNA after miR-US4-5p, miRNA negative control transfected to HEK293 cells, HELF cells, THP-1 cells.ResultsTwelve mRNAs, including PAK2(p21-activated Kinase 2), were identified as the targets of miR-US4-5p. Dual-luciferase assay showed the luciferase activity of PMIR-PAK2 was significantly down-regulated after transfection of miR-US4-5p compared to the miRNA negative control, which validated the binding of miR-US4-5p and PAK2. PAK2 expression was down-regulated by over-expressed miR-US4-5p in HEK293, HELF and THP-1 cells.ConclusionHCMV miR-US4-5p may have the ability to inhibit the protein expression of its target mRNA, PAK2, during infection.

human cytomegalovirus; microRNAs; PAK2

国家自然科学基金资助项目(81171580)；教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(20112104110012)

邵耀中,男,1988-05生,博士,助理研究员,E-mail:asdsaosao@163.com

2017-04-10

Q78

A

1007-6611(2017)08-0808-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.08.011