禽Ⅰ群腺病毒血清4型感染的诊断与防治

孙德君 柴华 冯艳男 杨朋欣 秦立鑫/哈药集团生物疫苗有限公司

禽Ⅰ群腺病毒血清4型感染的诊断与防治

孙德君 柴华 冯艳男 杨朋欣 秦立鑫/哈药集团生物疫苗有限公司

禽腺病毒分为3群。禽腺病毒Ⅰ群来自鸡、火鸡、鹅等禽类，具有共同的群特异抗原。Ⅱ群包括火鸡出血性肠炎、大理石脾病和鸡脾肿大症的病毒，这些病毒有可与Ⅰ群相区别的群特异抗原。Ⅲ群是与产蛋下降综合征有关的病毒以及来自鸭的相关病毒，具有与Ⅰ群部分相同的共同抗原。

与禽腺病毒Ⅱ群、Ⅲ群不同，禽腺病毒Ⅰ群作为病原体的作用尚未完全明确，作为自然感染的原发性病原体仍有争议。一般认为它可引起包涵体肝炎（IBH）。张泽纪等（1986）报道从广东3个大型鸡场进口AA鸡父母代鸡群采取203份血样用琼脂扩散试验检查结果，包涵体肝炎阳性率达7．5%～81%。越来越多的事实证明它在传染性法氏囊病和传染性贫血中可引起继发性病原的作用。

鸡包涵体肝炎(Inclusion Body Hepatitis， IBH)是由Ⅰ群禽腺病毒(Fowl adenovirus Ⅰ，FAV-Ⅰ)引起的一种急性传染病，该病以侵害肝脏为特征，可在肝细胞中形成嗜酸性或嗜碱性包涵体。其临床症状表现为个别鸡突然死亡，死亡鸡多体况良好，发病鸡表现为食欲不振，羽毛粗乱，嗜睡，严重贫血，鸡冠褪色，出现一过性水样便(卡尔尼克等， 1991)，一般在 48 h 内死亡或康复。 有研究表明，FAV-Ⅰ为机体常在的条件性致病病原，鸡马立克氏病（MD）、传染性法氏囊病（IBD）和鸡传染性贫血（CIA）等免疫抑制病能够明显增加 IBH 的发病率，增加该病的危害。尤其是传染性法氏囊病（IBD），其引起的免疫抑制，是IBH 发生的一大诱因，因此控制传染性法氏囊病的发生是预防 IBH的一种重要手段。该病呈急性经过，死亡率高，给禽业生产带来了巨大的经济损失。

一、发病情况

该鸡场饲养了2 000多只30日龄肉鸡，临床可见呼吸困难，鸡群中出现零星鸡只死亡。病鸡萎顿、蹲伏、羽毛蓬松，精神萎靡、鸡冠和面部皮肤苍白、排白绿色稀便。剖检病死鸡，主要病理变化为：可见大量心包积液、肝色浅质脆、肿大充血。

图1 病死鸡心包积液、肝色浅质脆、肿大充血

二、病理剖检病变

IBH 特征性病理剖检变化表现在肝脏和骨髓。肝脏肿大，边缘钝圆，表面有不同程度的出血点或条索状出血斑，质脆，褪色，呈淡黄色，胆囊充盈，内有大量胆汁淤积。偶尔可见肝脏有大小不一的坏死灶，并伴随血细胞浸润，使肝脏触之有凹凸不平的感觉。骨髓呈灰白色或黄色胶冻样病变、体积变小，法氏囊萎缩，内膜有出血点或出血斑，且切面无光泽。胸腺点状出血、萎缩、且颜色变深。脾脏体积变化不大，偶见个别病例脾脏肿大、出血。肾脏呈灰白色、肿大，表面有癖斑和疲点。肺充血、水肿，除此之外，可见大腿部肌肉、胸肌以及皮下组织有明显出血，脂肪黄染。

三、病理组织学变化

病理组织学特征性变化在肝脏，表现为肝细胞脂肪变性，肝脏实质中可见由多个肝细胞形成的形状不规则的坏死灶，有时可见小叶中心部位弥漫性细胞肿胀和坏死，伴发空泡变性和细胞膜破裂，肝细胞萎缩核固缩等变化。心脏病理变化不明显，仅见心肌纤维中间有大量的淋巴细胞和血细胞浸润。肾脏间质血细胞浸润，相邻肾小管上皮细胞出现坏死，有的肾小管上皮细胞出现脂肪变性并大量坏死，偶尔可见水泡变性。脾脏大量早幼粒细胞浸润，白髓中央动脉周围淋巴细胞散在坏死灶，鞘动脉四周网状细胞明显增生。 法氏囊淋巴小结内淋巴细胞数量减少，稀疏，偶尔会出现网状细胞的轻度增生。肺间质轻度水肿、有少量的红细胞侵润。

图2 病死鸡的心、肝、法氏囊、肾、脾、肺病理切片

四、实验室诊断

1.引物的设计合成。根据 GenBank 中已发表的Ⅰ群禽腺病毒 Hexon 基因核酸序列设计完成两对引物，预计扩增片段为500 bp。

上游引物为P1： 5'CGAGGTCTATACCAACACGAGCA-3'；下游引物为 P2： 5'-CGGCGCAGG TTAATGAAGTTATC-3'。引物由吉林库美生物工程技术有限公司合成。

2.病毒分离与鉴定。取疑似鸡包涵体肝炎病鸡的肝脏剪碎，按 1∶5（W/V）比例加入灭菌PBS进行匀浆处理，将匀浆液反复冻融 3次，4 000 r/min离心30 min，取上清液备用。上清液中加双抗（青霉素、链霉素）各3 000 U/ml，置4℃过夜，以8 000 r/min离心10 min，取制备的上清液以卵黄囊途径接种5日龄SPF鸡胚，0．2 ml/胚，于 37℃孵育，每日观察2次，收获24～144 h内死亡的鸡胚尿囊液，收集死胚尿囊液，进行HA试验及PCR鉴定。

3.病毒DNA的提取及PCR扩增。病毒液采用TaKaRa MiniBEST Viral RNA DNA Extraction Kit Ver．5．0 提取试剂盒，按说明书进行病毒DNA的提取。PCR反应采用25 ul体系： 灭菌双蒸水17 μl、10×PCR Buffer 2．5 μl、DNA 溶 液 2．0 μl、dNTP（2．5 mmol/μl）2 μl、上下游引物 1μl、Taq 酶 0．5 μl。PCR扩增程序为： 反应条件：95℃预变性 5 min，95℃变性50s，55℃退火45 s，72℃延伸50 s，35个循环，72℃延伸 10 min。 PCR反应完毕后，取6 μl PCR产物，1．0%琼脂糖凝胶进行电泳，于紫外灯下观察电泳结果。电泳结果显示，待检样本中可扩增出1条约500 bp的目的条带(图1)，而阴性对照未出现条带。而用禽流感病毒、新城疫病毒和鸡传染性法氏囊病病毒的引物，进行PCR检测，结果均为阴性。再结合发病情况和剖检变化，诊断为禽腺病毒4型感染。

图1 禽腺病毒4型Hexon基因的PCR产物电泳结果

四、防治措施

1．由于鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)和鸡传染性贫血因子(CAA)可能增强腺病毒的致病性，首先应控制或清除这两种病毒。腺病毒的抵抗力较强，此种病毒极易经鸡胚传至另一鸡群，因此防制工作必须从原种禽场做起。SPF鸡群的经验证明水平传播也是一个重要问题，要保持商品鸡群没有腺病毒感染是特别困难的。这就增加了其防控难度。因此，包涵体肝炎的预防关键还要从饲养管理和生物安全方面考虑。加强平时的饲养管理，尽量减少应激，避免从发病鸡场引进雏鸡等都能起到一定作用。保证雏鸡具有较高的 IBD母源抗体水平，防止发生传染性法氏囊病，对包涵体肝炎的预防也很重要。

2．Ⅰ群禽腺病毒具有群特异性抗原，而且有证据表明引起鸡包涵体肝炎的病毒中以某些特定血清型为主，这些都提示研制疫苗存在很大的可行性。有些养殖场以发病鸡的组织经灭活后制成组织灭活苗，对种鸡进行免疫，可使后代获得较高的母源抗体而得到保护。疑似感染 IBH 的雏鸡，要尽快饲喂VC 和VK 以及对肝脏无损害的广谱抗生素，可使损失降低到最低程度。由于IBH 主要侵害肝脏，因此切忌用对肝脏有损伤的药物，否则将加大死亡率。

（略）