莆田南日岛泥东风螺的形态、DNA条形码和同工酶初步分析

王朋云

(莆田市水产技术推广站，福建 莆田 351100)

莆田南日岛泥东风螺的形态、DNA条形码和同工酶初步分析

王朋云

(莆田市水产技术推广站，福建 莆田 351100)

为了解莆田南日岛泥东风螺(Babylonialutosa)种质情况，采集泥东风螺养殖群体，对其样本的壳高(H)、壳宽(B)、体重(W)数量性状进行测量、推导关系式，以线粒体16S rRNA与COI、核18S rRNA与18S-28S rRNA基因为靶序列进行扩增和测序，结合同源序列与同属的其他7种东风螺或蛾螺总科(Buccinoidea)相关序列比对计算，以蝾螺属(Turbo)中华蝾螺(T.chinensis)作外群构建系统发育树，并提取样本个体的酯酶(EST)、苹果酸酶(ME)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)和异柠檬酸脱氢酶(IDH)进行同工酶多态性分析。结果表明，南日岛泥东风螺(B.lutosa)个体之间壳面斑块不规则、螺壳形态差异不明显；系统发育树显示在东风螺属内泥东风螺和台湾东风螺(B.formosae)优先聚支、亲缘关系最近；个体间EST、SOD和IDH电泳观察到酶位点表达多态性，ME、LDH和MDH检测未发现酶带数多态性，仅存在酶活性表达差异。

泥东风螺；形态；DNA条形码；同工酶

泥东风螺(Babylonialutosa)隶属于腹足纲(Gastropoda)新进腹足超目(Caenogastropoda)高腹足总目(Hypsogastropoda)新腹足目(Neogastropoda)蛾螺总科(Buccinoidea)蛾螺科(Buccinidae)东风螺属(Babylonia)，其肉质营养丰富、鲜脆爽口、风味独特，食用价值较高，是中国东南沿海优质的经济贝类之一，因而在莆田地区泥东风螺(B.lutosa)的规模化养殖热潮持续上升。目前，国内对泥东风螺的研究多集中在育苗[1-2]、生长特性[3-5]、重金属毒性试验[6]、消化酶活性[7]、核型[8]、底播测产[9]和增殖放流[10-11]等方面，而关于序列多态[12]和同工酶方面的报道相对较少。东风螺属的几个种，其在外壳颜色、花纹等形态特征方面极为相似，且易受栖息环境影响而变化，仅凭经验观察其外部形态进行种质资源多样性调研是十分困难的，易产生分歧，阻碍了亲本选育和养殖、标准制定工作的顺利开展。DNA分子标记、同工酶生化标记分析物种遗传特征，是分类和遗传多样性研究中除传统形态标记外最常用的辅助方法，二者结合形态特征应用可有效协助提高样本种质资源分析的准确性。

作者通过测量来自南日岛泥东风螺的3个贝壳形态特征，克隆其4条基因条形码与蛾螺总科内部分相关序列片段的多态性、碱基组成特性或系统亲缘关系进行比较及6种同工酶的初步电泳分析，以期为今后南日岛泥东风螺种质企业标准及地方标准的制定、群体遗传结构和多样性研究等提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用的泥东风螺于2014年7—10月分批采自福建省莆田市秀屿区南日镇浮叶村养殖场，每批随机取30个以上色泽鲜亮、活力较好的个体为样本，连续充气暂养1～2 d，期间只换水不投喂。

1.2 方法

1.2.1 形态测定

用过滤海水轻柔地清洗泥东风螺外壳的附着物，吸水纸拭干后置于白瓷盘内，测量其壳高(H)、壳宽(B)和个体鲜重(W)，测量工具为游标卡尺(精确度0.02 mm)、电子天平(精准度0.000 1 g)，每个指标的测量个数在30枚以上。测量的数据以Excel软件进行整理，计算平均值、分析群体样本标准偏差并求出各性状之间的关系式。

1.2.2 DNA条形码

样本经灭菌海水清洗后，立即解剖取新鲜腹足肌肌肉组织，采用TIANGEN海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取基因组DNA。选用NCBI GenBank数据库中已公布的无脊椎动物、近缘种类的16S rRNA、COI和18S-28S rRNA基因通用或特异引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用Thermo Scientific Dream Taq Green PCR Master Mix(2×)，PCR反应体系为20 μL，扩增条件：95℃预变性6 min；95℃变性1 min，50～60℃退火1 min，72℃延伸1～3 min，35个循环；72℃延伸10 min。PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳、SYBR Green I染色后紫外灯下分别切取目的条带，采用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)回收，克隆后送交生工生物工程(上海)股份有限公司进行多轮双向测序。测序结果采用NCBI blastn在线程序分析核酸序列同源性，Clustal X package对位分析多序列，中华蝾螺(Turbochinensis)为外群，MEGA 4.0邻接法构建系统进化树，Kimura 2-parameter 计算遗传距离(bootstrap值重复1 000次)。

表1 用于泥东风螺16S rRNA、COI、18S rRNA和18S-28S rRNA基因扩增的引物

1.2.3 同工酶电泳

泥东风螺样本经双蒸水清洗后，立即解剖，称取0.5 g新鲜腹足肌肌肉组织，加入3倍体积、4℃预冷的PBS液冰浴剪碎，并充分冰浴匀浆，4℃冰箱中抽提1.0 h，离心(4℃、14 000 r/min、15 min)2次至上清液澄清，取上清液分装，置4℃保存备用。应用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对泥东风螺肌肉组织中的EST、ME、SOD、LDH、MDH和IDH同工酶进行分析，根据目的蛋白分子量选择合适的分离胶(pH 8.8，8.2%)和浓缩胶(pH 6.8，3.6%)，制胶凝固2 h，将新稀释的1×Tris-Gly电泳缓冲液倒入电泳槽，10 μL上清液与等体积甘油加样缓冲液混匀注入凝胶孔道，移入4℃冰箱内，设置参数(90 V、40 mA、4～8 h)进行电泳，电泳结束后胶板浸入新配制的染液[13]，按不同酶染规程要求(温度、避光等)振荡染色至条带清晰，经双蒸水轻柔冲洗干净、7%～10%冰醋酸脱色后采集图像信息。

2 结果

2.1 形态测定

泥东风螺样本主要为2龄贝33枚，个体之间壳面红褐色斑块不规则(图1)，另含1.8龄贝3枚、2.3龄贝3枚，群体样本总数共计39枚。经测量计算，所采南日岛泥东风螺群体样本的壳高(H)为2.00～5.25 cm，平均为(3.65±0.51)cm；壳宽(B)为1.22～2.86 cm，平均为(2.18±0.28)cm；体重(W)为2.08～22.17 g，平均为(8.66±3.36)g；壳高为壳宽的1.57～1.84倍，平均为(1.67±0.06)倍。壳高、壳宽关系式为B=0.678 2H0.901 4(R2=0.950 2)，体重、壳高关系式为W=0.600 5e0.713 7H(R2=0.959 3)，体重、壳宽关系式为W=0.448 0e1.330 8B(R2=0.972 6)，关系式R2值显示群体样品个体间螺壳形态存在的差异程度较不明显，壳高(H)、壳宽(B)和体重(W)3个表型性状两两间的相关性均较高。

2.2 DNA条形码

依据DL2000 Plus DNA Marker电泳分子量判别泥东风螺样品的16S rRNA、COI、18S rRNA和18S-28S rRNA基因疑似目的条带，目标基因序列经双向测序、拼接、去除引物后，分子量分别为510 bp(16S rRNA)、658 bp(COI)、1 787 bp(18S rRNA)和2 570 bp/2 576 bp(18S-28S rRNA)，提交GenBank数据库获得登录号KM411961(16S rRNA)、KM411963(COI)、KX185514(18S rRNA)和KX656904/KX656905(18S-28S rRNA)。核酸序列同源性在线比对表明，KM411961与数据库中其余4条泥东风螺相关序列相似性在99.6%以上，种内距离(0.003 2±0.004 1)，其中保守位点506个，变异位点4个，占总数0.8%，没有简约信息位点，自裔位点4个，A、T、C、G、(A+T)碱基平均含量分别为35.3%、29.6%、15.1%、20.0%、64.9%，(A+T)含量明显高于(G+C)，没有插入和缺失位点，转换突变的核苷酸位点2个，方式为C-T、T-C各1个，颠换突变的核苷酸位点2个，方式为A-T、T-A各1个，转换与颠换比为1.0；KM411963和另3条同源序列相似性大于97.8%，种内距离为(0.005 4±0.002 9)，其中保守位点652个，变异位点6个(0.9%)，简约信息位点3个，自裔位点3个，A、T、C、G、(A+T)碱基平均含量分别为24.5%、38.2%、18.4%、18.9%、62.7%，AT含量偏倚明显，编码氨基酸的3个密码子Pos #1、Pos #2和Pos #3中，碱基T的含量均为最高，依次为Pos #1(42.4%)>Pos #2(42.0%)>Pos #3(30.2%)，Pos #3中A、T、C、G的比例分别为21.5%、30.2%、20.9%、27.4%，插入位点1个(12碱基小片段)，没有缺失位点，转换突变的核苷酸位点6个，转换方式以A-G为主3个，其余C-T、T-C、G-A各1个，没有颠换突变的核苷酸位点；KX185514与库中的1条种内序列相似性达100.0%，种内距离为0.000 0，其中保守位点1 787个，没有变异位点、简约信息位点及自裔位点，A、T、C、G、(A+T)碱基平均含量分别为24.3%、25.0%、23.2%、27.5%、49.3%，(A+T)含量稍低于(G+C)，碱基组成偏向性不明显，没有插入和缺失位点、转换和颠换突变的核苷酸位点；KX656904/KX656905暂未检索到有种内同源序列公布，二者相似性为99.7%，种内距离0.001 6，其中保守位点2 566个，变异位点4个(0.2%)，没有简约信息位点、自裔位点，A、T、C、G、A+T碱基平均含量分别为20.2%、20.8%、28.0%、31.1%、41.0%，(A+T)含量明显低于(G+C)，插入位点2个(3碱基小片段)，没有缺失位点，转换突变的核苷酸位点1个，方式为C-T，颠换突变的核苷酸位点3个，方式为C-G，转换与颠换比为0.3。序列同源性分析表明南日岛泥东风螺与数据库样本间存在不同程度的遗传变异，由大到小依次为COI>16S rRNA>18S-28S rRNA>18S rRNA。

以中华蝾螺的相应序列为外群，同GenBank中检索到的东风螺属(Babylonia)或蛾螺总科(Buccinoidea)相关序列(均无内含子)进行对位排序、去除两端部分碱基、计算遗传距离值，构建分子系统发育树。东风螺属16S rRNA系统发育树明显分为两个簇群，即KM411961(莆田南日岛)与泥东风螺序列AB044255(东中国海)、HQ424447(海南临高)、HQ833937(福州福清)和KF897830(广西北海)先聚类成一支，再同台湾东风螺(B.formosae)序列DQ314762聚集、节点支持率100%，而后与日本东风螺(B.japonica)序列LC155101形成一个簇群；南洋象牙凤螺(B.lani)序列HQ424448则与方斑东风螺(B.areolata)的7条序列组成系统树的另一个亚簇。表明泥东风螺与台湾东风螺的亲缘关系最近，种间距离(0.003 6±0.003 5)(略大于泥东风螺不同地理标本间的种内距离)，同日本东风螺(B.japonica)、方斑东风螺(B.areolata)、南洋象牙凤螺(B.lani)次之，种间距离依次为(0.057 2±0.003 8)、(0.072 6±0.003 7)、(0.074 9±0.003 9)，与外群中华蝾螺种间距离为(0.268 8±0.004 8)；而南洋象牙凤螺和方斑东风螺具有较近的亲缘关系，种间距离为(0.002 5±0.000 9)；属内5种东风螺的遗传距离即台湾东风螺DQ314762与泥东风螺KM411961、KF897830、AB044255、HQ424447及南洋象牙凤螺HQ424448同方斑东风螺DQ314761、JN052947、HQ416443、JN052946、JN052948最小为0.002 0，泥东风螺HQ833937和南洋象牙凤螺HQ424448最大为0.081 9，与外群中华蝾螺的遗传距离在0.253 3～0.278 0之间(图2)。

同样，所构建的东风螺属COI系统树拓扑结构包含一大、一小两个分支，KM411963(莆田南日岛)首先与泥东风螺同源序列JN053010(海南)聚集，获得支持率97%，再与HQ424447(海南临高)、KF897830(广西北海)聚簇，最后与另相聚支的台湾东风螺序列DQ314764和日本东风螺序列AF373888组成系统树大分支的一个支系；大分支内的另一姊妹亚簇则由方斑东风螺的8条序列联合南洋象牙凤螺序列HQ424448及波部东风螺(B.habei)序列AY819773构成，支持率尚可；小分支为深沟东风螺(B.spirata)的8条序列与锡兰东风螺(B.zeylanica)序列JX573172形成，节点支持率为100%。系统树的聚类结果与前者较一致，显示东风螺属内泥东风螺和台湾东风螺、日本东风螺亲缘关系相近，种间距离分别为(0.010 2±0.002 7)、(0.013 8±0.002 7)，与南洋象牙凤螺、方斑东风螺也有一定的联系，种间距离分别为(0.121 2±0.004 6)、(0.130 5±0.001 3)，但同深沟东风螺、波部东风螺、锡兰东风螺亲缘关系较远，种间距离分别为(0.157 3±0.004 9)、(0.164 9±0.004 9)、(0.181 2±0.001 2)；另外，方斑东风螺与南洋象牙凤螺、波部东风螺有较近的系统关系，种间距离分别为(0.044 0±0.000 7)、(0.148 5±0.002 1)，而锡兰东风螺和深沟东风螺地理进化亲缘相近，种间距离为(0.079 1±0.003 8)；属内8种东风螺遗传距离最小的为台湾东风螺DQ314764与日本东风螺AF373888的0.003 5，最大的为锡兰东风螺JX573172和波部东风螺AY819773的0.236 8，与外群中华蝾螺遗传距离在0.259 7～0.312 7之间(图3)。

蛾螺科18S rRNA基因系统发育树构建结果显示KX185514(莆田南日岛)与泥东风螺序列HQ834022(福州福清)、方斑东风螺序列HQ834021及EU236272聚成一簇，节点支持率100%，再与Euthria属序列聚集，联合Japelion、Volutharpa、香螺属(Neptunea)序列形成的复合簇，先后同Crassicantharus属、甲虫螺属(Cantharus)和Phos属、Siphonalia及蛾螺属(Buccinum)水泡蛾螺(B.pemphigus)序列汇集。东风螺属内种间距离为(0.000 0±0.000 0)，与Euthria属的遗传距离最小，为(0.006 8±0.000 0)，同Volutharpa、香螺属、Japelion、甲虫螺属、Phos、Crassicantharus、蛾螺属、Siphonalia属的遗传距离渐增，依次为(0.006 8±0.000 0)、(0.009 1±0.001 2)、(0.009 6±0.000 0)、(0.011 9±0.000 0)、(0.012 5±0.000 0)、(0.013 7±0.000 0)、(0.014 1±0.001 5)、(0.018 1±0.001 6)，同外群中华蝾螺遗传距离为(0.140 0±0.000 0)；而Volutharpa属与Euthria、香螺属最小的遗传距离亦为0.006 8，为(0.006 8±0.001 4)；蛾螺科内最小的遗传距离为蛾螺属、Siphonalia两属的(0.005 5±0.002 3)，最大为Crassicantharus、Siphonalia两属的(0.025 6±0.001 7)，同外群中华蝾螺的遗传距离在0.139 2～0.146 3之间(图4)。

蛾螺科内选取28S rRNA基因序列多于1条的属进行分子进化树构建，结果呈现出多个分支，KX656904/KX656905(莆田南日岛)处于进化树的外支。遗传距离计算结果显示东风螺属与其余各属序列遗传距离从小到大分别为Eosipho属(0.049 1±0.000 0)、Manaria属(0.049 6±0.000 8)、Cancellopollia属(0.052 0±0.000 0)、香螺属(0.0530±0.0008)、Lirabuccinum属(0.058 3±0.000 0)、蛾螺属(0.062 3±0.000 8)、Belomitra属(0.065 5±0.002 2)、Colubraria属(0.065 6±0.007 0)、Crassicantharus属(0.070 7±0.000 0)，同外群中华蝾螺遗传距离(0.347 6±0.001 4)；而Eosipho属与Manaria、Lirabuccinum属遗传距离较小，分别为(0.010 6±0.000 8)、(0.024 8±0.000 0)；蛾螺科内最小遗传距离为Eosipho、Manaria两属的(0.010 6±0.000 8)，最大为东风螺、Crassicantharus两属的(0.070 7±0.000 0)，同外群中华蝾螺的遗传距离在0.338 8～0.353 6之间(图5)。

蛾螺总科ITS1全序列检索到蛾螺科东风螺属的6条、细带螺科(Fasciolariidae)赤旋螺属(Pleuroploca)四角赤旋螺(P.filamentosa)的1条、核螺科(Columbellidae)麦螺属(Euplica)花麦螺(E.scripta)的1条、织纹螺科(Nassariidae)织纹螺属(Nassarius)的若干条，构建的进化树显示KX656904/KX656905(莆田南日岛)聚支后同方斑东风螺的6条序列组成的簇群汇集，再与麦螺属、赤旋螺属的序列集合；进化树的另一簇群由织纹螺属的9种织纹螺序列聚成。泥东风螺种内距离为0.003 2，与方斑东风螺种间距离为(0.016 4±0.002 3)，与麦螺属、赤旋螺属种间距离分别为(0.362 5±0.003 5)、(0.410 2±0.000 7)，与织纹螺属种间距离为(0.473 2±0.008 8)，与外群中华蝾螺种间距离为(1.047 1±0.006 9)；而方斑东风螺种内距离为(0.003 4±0.002 2)，同外群中华蝾螺种间距离为(1.069 3±0.006 1)；属内2种东风螺的遗传距离即泥东风螺KX656905和方斑东风螺EF117975、EF490206最小，为0.012 7，泥东风螺KX656904和方斑东风螺EF490207、EF490208、EF490209、EF490210最大，为0.019 1，与外群中华蝾螺的遗传距离在1.041 1～1.073 4之间(图6)。

蛾螺总科ITS2全序列现时只公布了蛾螺科蛾螺属日本海峨螺(B.striatissimum)的3条、细带螺科(Fasciolariidae)细带螺属(Fasciolaria)的1条，分析序列构建的系统树显示KX656904/KX656905(莆田南日岛)聚支后并入蛾螺属、细带螺属序列组成分支的外侧。泥东风螺种内遗传距离为0.000 0，与F.lignaria种间遗传距离为(0.172 5±0.000 0)，与蛾螺属种间遗传距离为(0.198 7±0.000 0)，与外群中华蝾螺种间遗传距离为(0.398 5±0.005 3)；而蛾螺属、细带螺属序列种间遗传距离为(0.117 6±0.000 0)，同外群中华蝾螺种间遗传距离分别为(0.376 5±0.004 8)、(0.390 2±0.006 4)(图7)。

2.3 同工酶电泳

酶谱(仅示例30枚样本中的01～15号个体)显示南日岛泥东风螺个体间腹足肌组织中各同工酶酶带的迁移速率、组成分布在某种程度上较一致，表明相关基因在群体内的表达和调控具有部分稳定性。酯酶(EST)为正染色，呈现出相似的约7～8条酶带，酶位点活性表达强弱不同，甚至个别缺失，群体内个体间多态性可见差异明显；苹果酸酶(ME)为正染色，仅观察到1条酶带，但表达极其微弱，不易辨别；超氧化物歧化酶(SOD)为负染色，多数个体检测到2条酶带，少数(09、12号个体)检测到3条酶带，个体间表达差异较明显；乳酸脱氢酶(LDH)为正染色，呈现出2条表达很弱的酶带；苹果酸脱氢酶(MDH)为正染色，观察到2条较弱的酶带，其中向正极泳动稍快的表达相对更弱；异柠檬酸脱氢酶(IDH)为正染色，大部分个体检测到2条酶带，小部分为3条，群体内个体酶位点表达具有一定的差异性(图8)。

3 讨论

3.1 形态测定

通过研究样本个体的形态结构进行系统分类是生物分类学的经典方法，腹足纲的分类鉴定主要是依据贝壳的形状、壳色、有无生长线[14]、齿舌结构等形态学、解剖学特征，各形态指标之间有着部分直接或间接的相关性。观察发现，南日岛泥东风螺样本个体螺壳呈长卵形、右旋，缝合线明显，白色壳面外被有一层黄褐色的壳皮，脐孔小且明显、不深，厣棕褐色、角质，生长线明显。形态学、解剖学特征易于收集、测定和保存记录，能够直观、全面而系统地反映出样本特征，在物种的研究中有着不可替代的地位。利用光学显微镜研究发现，蛾螺科中东风螺属泥东风螺、方斑东风螺、台湾东风螺和深沟东风螺与其它属种类的齿舌形态在中央齿小齿的大小和数目、中央齿基板的性状以及侧齿小齿的数目上互相体现出明显的区别[15]，泥东风螺和方斑东风螺的齿舌因具有种特异性而存在差异[16]。螺壳的外部形态特征是目前东风螺属种类鉴定的主要依据，泥东风螺与营固着生活的海产动物牡蛎等相比，较少受外源影响如个体间挤压而使贝壳产生形变[17-18]，同时养殖群体相比野生种类，受敌害生物、饵料、底质和水温等生境条件的影响[19-20]较小，因而贝壳外形较稳定一致，形态标记个体差异小，易于观察测量、记录和分析，因此南日岛泥东风螺样本的壳高、壳宽与体重3个表型性状间的相关性、关系式R2值与莆田牡蛎的贝壳形态测定数据[18]相比更高、更加可靠，结果亦显示在观测指标范围内，南日岛泥东风螺养殖群体个体间贝壳的形态较一致，除外表面的颜色斑块色泽、形状无规律外，其他变化差异不明显，个体的鲜总体重(W)优先与螺壳的壳宽(B)呈一定的相关性，其次是螺壳的壳高(H)；所抽取的样本暂未观察到花纹具有特异统一的现象，不容易测量计数，颜色斑块的不同变化可能是受个体自身特性或环境的影响。

注：A：酯酶(EST)；B：苹果酸酶(ME)；C：超氧化物歧化酶(SOD)；D：乳酸脱氢酶(LDH)；E：苹果酸脱氢酶(MDH)；F：异柠檬酸脱氢酶(IDH)。

Notes：A.Esterase(EST)；B.Malic enzyme(ME)；C.Superoxide dismutase(SOD)；D.Lactate dehydrogenase(LDH)；E.Malic dehydrogenase(MDH)；F.Isocitrate dehydrogenase(IDH).

3.2 DNA条形码

基因和生境共同影响着贝壳的形态特征，利用DNA或RNA条形码序列的扩增测定、同工酶电泳分析、染色体核型和计数等分子标记技术结合形态参数，可以更加有效、准确地了解分析种质资源、群体的遗传多样性和系统学分类关系等情况，借助于形态分析和DNA分子标记技术，解决了莆田牡蛎的常见养殖种类究竟是僧帽牡蛎(Saccostreacucullata)、褶牡蛎(Crassostreaplicatula)还是葡萄牙牡蛎(C.angulata)的争议[18，20]。线粒体基因已广泛应用于海洋生物特别是无脊椎动物的分子鉴定[21]、群体遗传分化[22]、亲缘关系[23-24]和系统发育研究[25-26]，而质体、核基因则更多被引入辅助探讨植物的鉴定[27-29]，如藻类的种类[30-31]和进化关系[32-33]，是非常有效的分子标记。依实验16S rRNA、COI、18S rRNA、28S rRNA、ITS1和ITS2基因序列的数据库资料丰富程度、碱基组成、种内/种间遗传距离和系统发育树构建结果，表明线粒体基因片段COI是研究东风螺属内种类序列遗传多态性的理想DNA条形码。南日岛泥东风螺样本的16S rRNA、COI序列碱基组成(A+T)含量分别为64.9%、62.7%，都明显高于(G+C)，碱基组成偏向性符合线粒体(蛋白编码)基因的碱基组成特点；18S rRNA碱基(A+T)含量为49.3%，几乎不存在偏倚性；18S-28S rRNA碱基(A+T)含量41.0%，略低于(G+C)含量，这些结果与其他腹足纲螺类基因碱基组成相似。样本的18S-28S rRNA产物多次直接双向测序时发现，每轮通用/特异引物反应经过ITS区，极易出现双峰干扰或失败，结果无法成功比对，必需经过连接转化处理后才能顺利进行，ITS区很有可能因两端进化较快，存在复杂的二级结构，不利于测序引物的锚定结合；且克隆后测序结果发现了2个插入突变的核苷酸位点，推测这2个突变位点很可能与样本个体的遗传特质或测序相关。通过对东风螺属8个种的16S rRNA、COI条形码系统学分析可以看出，属内的泥东风螺与台湾东风螺、日本东风螺这2个种聚到一起成为一支，bootstrap值较高，推断是属里较为亲近的种，与其它种的亲缘关系稍远，特别是泥东风螺同台湾东风螺的遗传距离和序列差异度更小，说明分类地位与系统学进化关系最近。而基于COI基因序列重建的系统发育树中，东风螺属的8个种形成两个明显的大亚群，采集自中国沿岸或东中国海的泥东风螺、台湾东风螺、日本东风螺、南洋象牙凤螺、方斑东风螺和波部东风螺聚为一个大亚群，组成另一个大亚群的是采捕自印度洋海区的深沟东风螺和锡兰东风螺，表明分布于不同大洋海域的样本，由于地理隔离难以产生有效的基因交流，同时，空间距离邻近的样本亲缘关系也有一定的相关性。

3.3 同工酶电泳

同工酶电泳用于群体遗传学研究能够有效检测出样本居群特异条带的多寡，度量群体结构的遗传变异，成功应用于葡萄牙牡蛎[18]、紫贻贝(Mytilusedulis)[34]和毛蚶(Scapharcasubcrenata)[35]等海洋贝类，发现在紫贻贝体内的鳃、消化腺、外套膜、足和闭壳肌5种组织中SOD、三磷酸腺苷酶(ATPase)、MDH及ME存在着一定的特异性表达差异；而毛蚶的消化腺和外套膜2种组织中EST、LDH、乙醇脱氢酶(ADH)、MDH、ME、谷氨酸脱氢酶(GDH)、淀粉酶(AMY)、SOD同磷酸葡萄糖变位酶(PGM)图谱表明江苏海州湾、浙江象山港与辽宁辽东湾3个海区各群体杂合子缺失现象普遍存在。分析南日岛泥东风螺养殖群体内不同个体间的生化遗传特征，腹足肌肌肉组织中的EST、ME、SOD、LDH、MDH和IDH的酶谱结果只有SOD为负染色；而EST的酶谱表型条带相对数量较多和复杂，条带显色深浅不一；ME、LDH和MDH染色方案多次调整仍得不到清晰的酶带，可能在腹足肌肌肉组织中活性表达不强，或者还未找准最适宜的显色方法。6种同工酶初步染色的结果即活性有无、酶带表达强弱、清晰度大小和多态性揭示，后续可选其中的EST与SOD继续优化和方法改进，记录迁移率、基因位点和等位基因等，并进行同工酶的基因型频率、等位基因频率等评估居群的遗传变异参数的计算，用于研究南日岛泥东风螺养殖个体不同组织中同工酶有无存在一定的组织特异性，以及群体内的不同基因型和遗传学结构。样本同工酶的多态性比例不高，说明该养殖群体的遗传结构简单，可能是繁殖亲本的遗传背景贫乏、亲本个体数量少、基因交换机会小或多次同地相近亲本交配，无法为子代提供丰富的遗传多样性。为了避免样本不同个体间解剖或抽提等操作过程中的相互污染和防止干扰降低多态性，可备多套工具循环，每枚个体用毕需及时清洁消毒，尤其是在样本包含个体数较多时，清洁消毒更为重要。

致谢：实验先后得到中国海洋大学海洋生命学院海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室茅云翔教授、国家海洋局第三海洋研究所海洋生物遗传资源重点实验室陈建明研究员和福建省水产研究所福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室曾志南研究员的帮助与支持，谨致谢忱。

[1]郑雅友，苏新红，曾志南，等.两种培育方法对泥东风螺稚螺生长与存活的影响[J].福建水产，2014，36(6)：459-464.

[2]林国清，林丹，陈曦飞，等.泥东风螺(Babylonialutosa)规模化人工育苗技术和早期发育观察[J].福建水产，2015，37(1)：20-28.

[3]郑雅友，曾志南，刘波，等.几种天然饵料对泥东风螺稚螺生长、存活的影响[J].福建水产，2013，35(4)：301-306.

[4]刘波，曾志南，郑雅友，等.泥东风螺(Babylonialutosa)幼螺对不同饵料、盐度和酸碱度的适应性研究[J].福建水产，2014，36(5)：376-380.

[5]郑雅友，苏新红，曾志南，等.低盐度对泥东风螺(Babylonialutosa)稚螺生长与存活的影响[J].福建水产，2015，37(1)：29-35.

[6]林国清.4种重金属盐对泥东风螺幼螺的急性毒性试验[J].福建农业学报，2012，27(3)：232-236.

[7]陈曦飞.不同饵料添加剂对泥东风螺幼螺生长及消化酶活性的影响[J].福建水产，2015，37(4)：301-307.

[8]陈菲，骆轩，沈铭辉，等.两种东风螺的染色体核型[J].厦门大学学报(自然科学版)，2011，50(4)：789-793.

[9]叶泉土，巫旗生，曾志南，等.不同底播密度对泥东风螺(Babylonialutosa)幼螺生长和存活的影响[J].福建水产，2015，37(1)：36-42.

[10]叶泉土，刘勇，曾志南，等.泥东风螺增殖放流跟踪调查及效果分析[J].福建水产，2015，37(2)：140-147.

[11]祁剑飞，曾志南，宁岳，等.底栖动物增殖放流生态风险评价[J].水产学报，2016，40(7)：1099-1105.

[12]秦溱，王晓清，曾志南，等.泥东风螺4个群体遗传多样性的AFLP分析[J].湖南农业大学学报(自然科学版)，2014，40(3)：299-304.

[13]朱蓝菲.鱼类同工酶和蛋白质的聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳法[J].水生生物学报，1992，16(2)：183-185.

[14]WILKE T，FALNIOWSKI A.The genusAdriohydrobia(Hydrobiidae：Gastropoda)：polytypic species or polymorphic populations?[J].Journal of Zoologicd Systematics & Evolutiorary Research，2001，39(4)：227-234.

[15]李海涛，朱艾嘉，方宏达，等.蛾螺科、织纹螺科和细带螺科腹足类齿舌的形态学研究[J].海洋与湖沼，2010，41(4)：495-499.

[16]周峥桢，沈铭辉，柯才焕，等.不同群体东风螺属齿舌的比较[J].厦门大学学报(自然科学版)，2007，46(1)：167-170.

[17]巫旗生，王晓清，曾志南，等.中国牡蛎分类方法研究进展[J].福建水产，2011，33(1)：67-72.

[18]王朋云.莆田后海养殖牡蛎的形态学观察和分子鉴定[J].福建水产，2013，35(2)：100-105.

[19]TRUSSELL G C.Phenotypic clines，plasticity，and morphological trade-offs in an intertidal snail[J].Evolution，2000，54(1)：151-166.

[20]巫旗生，宁岳，曾志南，等.福建沿海牡蛎养殖群体的多重种类特异性PCR分析和形态参数比较[J].福建水产，2014，36(1)：7-13.

[21]李琪，邹山梅，郑小东，等.DNA条形码及其在海洋生物中的应用[J].中国海洋大学学报(自然科学版)，2010，40(8)：43-47.

[22]宁岳，巫旗生，徐德华，等.不同地理群体裸体方格星虫遗传结构及种群分化研究[J].福建水产，2012，34(2)：91-98.

[23]林昕，王鹏，杜琦，等.福建沿海不同养殖区泥蚶的ITS-1基因片段序列分析[J].福建水产，2008，30(1)：61-65.

[24]王超，陈爱华，曹奕，等.6个不同海域文蛤地理群体的亲缘关系分析[J].海洋渔业，2016，38(3)：262-272.

[25]毛阳丽，蔡厚才，李成久，等.基于线粒体COI与16S rRNA基因序列探讨贻贝属的系统发育[J].南方水产科学，2010，6(5)：27-36.

[26]林森杰，王路，郑连明，等.海洋生物DNA条形码研究现状与展望[J].海洋学报，2014，36(12)：1-17.

[27]GROUP C P W,HOLLINGSWORTH P M，FORREST L L，et al.A DNA barcode for land plants[J].Proceedings of the National Academy of Scien ces of the USA，2009，106(31)：12794-12797.

[28]程希婷，王爱民，顾志峰，等.DNA条形码研究进展[J].基因组学与应用生物学，2011，30(6)：748-758.

[29]NEVES S S，FORREST L L.Plant DNA sequencing for phylogenetic analyses：from plants to sequences[J].Methods in Molecular Biology，2011，781：183-235.

[30]刘平怀，杨勋，郝宗娣，等.产油微藻的分离鉴定及营养方式对其油脂积累的影响[J].南方水产科学，2013，9(6)：27-32.

[31]蔡永超，孙彬，马家海，等.我国南黄海海域漂浮铜藻的分子生物学鉴定[J].海洋渔业，2014，36(2)：102-106.

[32]陈斌斌，马家海，张天夫，等.中国沿海石莼属绿藻的ITS和5S rRNA序列分析[J].海洋渔业，2012，34(3)：249-255.

[33]王朋云.丛粒藻细胞的透射电镜观察和rbcL、18S rRNA序列分析[J].淡水渔业，2014，44(3)：3-9.

[34]刘慧慧，常抗美.紫贻贝4种同工酶的组织特异性表达研究[J].南方水产科学，2008，4(4)：60-63.

[35]李旭光，阎斌伦，许广平，等.毛蚶三个地理群体生化遗传特征分析[J].海洋渔业，2007，29(3)：207-213.

A preliminary analysis on the morphology，DNA barcoding and isozyme of theBabylonialutosafrom Nanri Island in Putian

WANG Pengyun

(Fisheries and Aquaculture Technology Extension Station of Putian，Putian 351100，China)

Babylonialutosaaquaculture scale has been expanded rapidly with the important economic value and increasing demand in recent years.It becomes more and more necessary to research and understand some information about identification，molecular markers，genetic relationship，genetic polymorphism and construction of phylogenetic tree of shellfish germplasm resources in Putian.The morphological characteristics and key measurable character indicators such as body height(H)，body width(B)and body weight(W)of 39 individuals at different stages cultivated in outdoor breeding pond from Nanri Island were observed and measured in order to derive the calculation formula between these traits.The mitochondria 16S rRNA，COI as well as nuclear 18S rRNA，18S-28S rRNA were amplificated by means of PCR and sequenced as a target gene sequence，respectively.TakingTurbochinensisas an outgroup，the Neighbor-Joining phylogenetic trees involved in the other seven species ofBabyloniaor related homologous sequences of Buccinoidea were reconstructed based on the analysis and comparison of sequence similarities and genetic distances of 16S rRNA，COI，18S rRNA，28S rRNA，ITS1 and ITS2 genes.Also，the enzymatic activities and polymorphism of six isozymes including Esterase(EST)，Malic enzyme(ME)，Superoxide dismutase(SOD)，Lactate dehydrogenase(LDH)，Malic dehydrogenase(MDH)and Isocitrate dehydrogenase(IDH)extracted from the foot muscle tissue were analyzed by using polyacrylamide gel electrophoresis.The results showed that there was no significant difference among the individual shapes of theB.lutosashells except for obviously irregular pattern.The average of body height(H)，body width(B)，body weight(W)and ratio of body height(H)to body width(B)were arranged in turn as(3.65±0.51)cm，(2.18±0.28)cm，(8.66±3.36)g and(1.67±0.06)times,respectively.While the relationship between body height and body width，body weight and body height，body weight and body width growth equations could be successively described by the power function B=0.678 2H0.901 4(R2=0.950 2)，exponential function W=0.600 5e0.713 7H(R2=0.959 3)and W=0.448 0e1.330 8B(R2=0.972 6),respectively.Topology of COI phylogenetic tree suggested thatB.lutosaandB.formosaeclustered together first in the genusBabylonia.AndB.lutosaexisted in the closest phylogenetic relationship withB.formosaesimultaneously.Meanwhile，the genetic distances betweenB.lutosaandB.japonica，B.lani，B.areolata，B.spirata，B.habeiandB.zeylanicaincreased gradually.All the six isozymes were found expressing in the foot tissue.EST，SOD and IDH were detected with locus polymorphism among individuals.ME，LDH and MDH showed no site polymorphism in the number of enzyme bands and merely the presence of enzyme activity difference were examined.The study will provide a valuable reference for further research ofB.lutosa.

Babylonialutosa；morphology；DNA barcoding；isozymes

2017-05-04

福建省海洋高新产业发展专项[闽海洋高新(2014)05号]；福建省渔业推广项目(FJYYTG2012-07)；莆田市科技计划项目(2012N09).

王朋云(1982-)，男，青岛人，工程师，硕士，从事水产养殖及病害防治研究.Tel：0594-2690245.E-mail：foxgpy@126.com

S917.4

A

1006-5601(2017)04-0249-15

王朋云.莆田南日岛泥东风螺的形态、DNA条形码和同工酶初步分析[J].渔业研究，2017，39(4)：249-263.