基于促甲状腺功能的姜黄素延长低温冷冻小鼠生存时间的作用机制研究

李照雪，胡思远，王吉烨，陈泽慧，张闪闪，张 波

(1. 石河子大学药学院，2.石河子大学医学院第一附属医院心胸外科，3.新疆特种植物药资源教育部重点实验室，新疆 石河子 832002)

基于促甲状腺功能的姜黄素延长低温冷冻小鼠生存时间的作用机制研究

李照雪1,3，胡思远2，王吉烨1,3，陈泽慧1,3，张闪闪1,3，张 波1,3

(1. 石河子大学药学院，2.石河子大学医学院第一附属医院心胸外科，3.新疆特种植物药资源教育部重点实验室，新疆 石河子 832002)

目的低温冷冻会对恒温动物生理系统造成严重损害，寻找冻害防护的药物成为研究热点。方法该文以姜黄素(curcumin，Cur)对小鼠冷冻损害保护作用与甲状腺功能评价为研究内容。定量分析小鼠(-20±1)℃冷冻暴露生存时间、代谢指标的变化；ELISA试剂盒检测血清游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)含量；HE染色观察甲状腺组织形态；实时荧光定量PCR法检测甲状腺功能相关基因的表达。结果姜黄素(12.5～50 mg·kg-1)腹腔注射给药能明显延长冷冻暴露小鼠的生存时间；甲状腺HE形态学显示姜黄素逆转了冷冻导致的滤泡破损；姜黄素组代谢指标改善明显，血清FT3、FT4激素含量明显增高，甲状腺功能相关基因甲状腺细胞钠碘转运体(sodium iodide symporter，Nis)、甲状腺球蛋白(thyroglobulin，Tg)、甲状腺过氧化物酶(thyroid peroxidase，Tpo)mRNA的表达明显上调，促甲状腺激素受体(thyroid-stimulating hormone receptor，Tshr)mRNA的表达下调，这些促甲状腺作用与左旋甲状腺素钠(sodium levothyroxine，L-T4)呈协同作用，且可被丙硫氧嘧啶(propylthiouracil，PTU)所抑制。结论姜黄素延长小鼠生存的低温冷冻保护作用与其促进甲状腺功能密切相关。

姜黄素；冷冻损伤；甲状腺；生存时间；昆明小鼠；丙硫氧嘧啶；左旋甲状腺素钠

寒冷是影响人体生理、行为功能的环境应激因素。哺乳动物有完善的体温调节机制，低温冻害会引起机体体温调节的神经内分泌系统紊乱，最终导致死亡[1]。避免机体冻伤、提供低温冻害防护在西北寒区具有积极意义。干姜在西域少数民族药物与饮食中有悠久的使用历史与文化传统，国内外鲜有干姜活性分子的冷冻损伤防护作用报道。课题组前期研究发现干姜提取物能提高冷冻暴露下小鼠的生存时间，近年来其活性分子姜黄素(curcumin，Cur)成为研究热点(结构式见Fig 1)，其抗炎、改善微循环、降血糖以及抗肿瘤机制研究取得较大进展[2-3]。但其对低温冷冻是否存在保护作用及甲状腺功能的影响尚未见报道，因此，姜黄素对冷冻小鼠的保护作用与甲状腺激素代谢关系成为本文研究目标。

Fig 1 Structure of curcumin

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 实验动物 ♂昆明小鼠18～22 g，购自新疆维吾尔自治区动物研究中心，许可证编号：SCXK(新)2011-0001；批次：3批，2015年10月～2016年10月。

1.1.2试剂与仪器 姜黄素(纯度≥98%)购买于上海源叶生物科技有限公司(批号：R25M6S1)；丙硫氧嘧啶(propylthiouracil，PTU)购自上海朝晖药业有限公司；左旋甲状腺素钠(sodium levothyroxine，L-T4)购自默克雪兰诺有限公司；血清FT3、FT4 ELISA试剂盒，购自上海西塘生物科技有限公司；UNIQ-10柱式TRIzol总RNA提取试剂盒购自上海生物工程股份有限公司,批号13909KA1108；cDNA逆转录试剂盒购自TaKaRa公司，批号AK5401；实时荧光定量扩增试剂盒购自德国QIAGEN公司，批号208054；引物由上海生工生物工程公司合成。多功能酶标仪(Thermo VarioFlash 3001，Thermo，美国)；低温离心机(5424，Eppendorf，德国)；实时荧光定量PCR仪(Rotor-Gene Q，QIAGEN，德国)。

1.2方法

1.2.1动物分组及给药 参考文献[4]，取健康♂小鼠96只，随机分成8组，每组12只。分别为对照组：上午10点对小鼠进行腹腔注射生理盐水，连续给药8 d；姜黄素不同剂量组(12.5、25、50 mg·kg-1·d-1)治疗组：上午10点分别对3组小鼠进行腹腔注射姜黄素溶液，连续给药8 d[5]；甲减模型组、甲减姜黄素治疗组：甲减组小鼠按PTU 220 mg·kg-1·d-1灌胃，连续造模20 d[6]，再将小鼠随机分为甲减模型组和甲减姜黄素治疗组，两组小鼠分别上午10点对小鼠进行腹腔注射生理盐水溶液和姜黄素溶液(50 mg·kg-1·d-1)，连续给药8 d；甲亢模型组、甲亢姜黄素组：甲亢组小鼠按L-T4 350 μg·kg-1·d-1皮下注射，连续造模7 d[7]，再将小鼠随机分为甲亢模型组和甲亢姜黄素组，两组小鼠分别于上午10点对小鼠进行腹腔注射生理盐水溶液和姜黄素溶液(50 mg·kg-1·d-1)，连续给药8 d。

1.2.2小鼠寒冷暴露实验 本实验分为两部分，第1部分，实验d 8将实验各组小鼠放在预冷后的鼠笼内，将其暴露在维持(-20±1)℃的冷应激环境中，暴露2 h后摘眼球取血，分离血清，-80 ℃保存。第2部分，实验d 8将各组小鼠进行(-20±1)℃的持续冷暴露，直至小鼠休克惊厥，观察老鼠的行为、状态和惊厥时间的变化[8]。1.2.3实验动物基本指标观察 冷冻处理前预先给药阶段观察小鼠的神态、活动情况、饮食饮水量、口唇耳色泽、皮毛情况。每天监测各组小鼠的肛温、饮水量及体重的变化，用电子天平测量体重及饮水量，小鼠肛温电子温度计(wi78653，北京东西仪科技有限公司)测量小鼠肛温变化，并测量冷冻处理2 h后的小鼠肛温，以上数据均分别测量2次，取均值进行比较。

1.2.4甲状腺分泌相关指标检测 采用化学发光法(ELISA)检测血清三碘甲状腺原氨酸(FT3)、甲状腺素(FT4)水平的变化情况。

1.2.5小鼠甲状腺组织形态学观察 眼眶采血处死小鼠，将附着甲状腺的气管截取，立即取出甲状腺组织，用 4%甲醛溶液固定，梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，采用苏木精伊红(HE)染色法，光学显微镜(200×)观察甲状腺细胞变性、胶原纤维增生程度等组织形态学变化[9]。

1.2.6实时荧光定量PCR法检测甲状腺组织中甲状腺功能相关因子的表达 使用实时荧光定量PCR方法检测甲状腺功能相关基因Tg、Tpo、Tshr、Nis的表达变化。使用UNIQ-10柱式TRIzol总RNA提取试剂盒提取总RNA，定量检测RNA水平及含量，并用cDNA反转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。PCR 反应条件为：94 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 45 s。循环扩增40次结束后，获得Tg、Tpo、Tshr、Nis mRNA的循环域值(cycle threshold，Ct)，应用ΔΔCt(ΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt内参基因)方法分析，计算出2-ΔΔCt目的基因的相对表达量后，进行统计分析[10]。引物序列及退火温度见Tab 1。

2 结果

2.1姜黄素延长冷冻小鼠生存时间并改善神经与代谢表观指标小鼠冷冻处理后，对照组小鼠于170 min左右出现惊厥或死亡，在220 min对照组小鼠全部惊厥或死亡，平均生存时间为194 min。高剂量姜黄素治疗组的小鼠生存时间最长，在220 min开始出现惊厥或死亡，到320 min全部惊厥或死亡，平均生存时间为262 min。中剂量组小鼠于200 min开始出现惊厥或死亡，到270 min全部惊厥或死亡，平均生存时间为233 min。低剂量组小鼠于190 min开始出现惊厥或死亡，到240 min全部惊厥或死亡，平均生存时间为212 min。由Fig 2可以看出，姜黄素给药可以明显提高冷冻处理小鼠的生存时间，且呈现一定的量效关系(P<0.05)。冷冻处理前，对照组小鼠口唇红润，毛发有光泽，耳朵、尾巴呈淡粉色，食量正常，体重逐渐增加，呼吸平稳，反应灵敏，饮水、饮食量、肛温、便质正常；腹腔注射姜黄素后，小鼠无刺激性反应，体态无异常改变，正常进食、饮水。与对照组相比，治疗组小鼠行为无明显改变，体重明显降低，平均体重减少0.72 g(P<0.05)，饮水量明显增加，每笼小鼠(5只)平均增加饮水5.37 mL(P<0.05)，肛温明显增加，平均增加0.52 ℃(P<0.05)，见Tab 2。各组小鼠在-20℃寒冷暴露后，均表现为聚堆，惊恐不安、紧张、眼球突出，目光锐利、心率加快、呼吸急迫、肛温明显降低，食欲减退或废绝、肌肉震颤，尾根抖动、少尿或无尿，有时频频排粪尿。而姜黄素治疗组小鼠冷冻处理后生存状态较好，出现该现象较对照组平均晚32.5 min。

Tab 1 Primer sequences

Tab 2 Effect of drugs on basic index of mice(±s,n=12)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 2 The survive time of mice under(-20 ± 1)℃(n=12)

2.2姜黄素提高小鼠血清FT3、FT4的分泌水平与对照组相比，姜黄素治疗组血清FT3(Fig 3A)、FT4(Fig 3B)分泌水平明显升高(P<0.01)，呈浓度剂量依赖性升高，且高剂量姜黄素对血清FT3、FT4分泌水平的促进作用最强，差异具有统计学意义。

2.3姜黄素减轻小鼠甲状腺组织结构的损伤如Fig 4所示，正常空白组甲状腺镜下可见滤泡大小不等，为圆形、椭圆形或不规则形。滤泡上皮为单层立方上皮，细胞呈柱状，核圆。滤泡内充满嗜酸性染色的胶质，并有空泡现象。滤泡间分布有结缔组织和毛细血管(Fig 4A)。冷冻处理对照组甲状腺外观明显肿大，镜下甲状腺组织呈结节状分布，结节大小不一，血管丰富。滤泡大小差异较大，可见滤泡腔扩大，部分滤泡聚集消失形成较薄的结缔组织分隔的结节，滤泡上皮细胞呈立方状，腔内胶质减少(Fig 4B)。姜黄素治疗组与对照组相比较，肉眼观察甲状腺肿大程度有所减轻，镜下观察甲状腺组织分布较均一，组织内血管增多现象不明显。上皮细胞呈立方体，腺泡扩大，见大量均一红染胶质(Fig 4C～4F)。且姜黄素对小鼠甲状腺组织损伤的逆转作用呈剂量依赖性，高剂量改善效果明显。

Fig 3 Effects of curcumin on thyroid hormone FT3(A)and FT4(B) activity in mice after cold treatment(±s,n=12)

Tab 3 Effect of curcumin on basic index of hypothyroidism and hyperthyroidism in mice(±s,n=12)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vscurcumin;ΔP<0.05,ΔΔP<0.01vsPTU

Fig 4 Effects of different concentrations of curcumin onthyroid tissue structure after cold treatment in mice(n=12)

2.4姜黄素上调小鼠甲状腺功能相关因子Tshr、Nis、Tg、Tpo mRNA的表达如Fig 5所示，姜黄素低、中、高剂量治疗组Nis、Tg、Tpo mRNA的表达较对照组明显增高，随着姜黄素剂量的增加，Nis、Tg、Tpo mRNA的表达也逐渐增加；与对照组相比，姜黄素低、中、高剂量治疗组促甲状腺素受体(Tshr)的表达明显减少，随着姜黄素剂量增加，Tshr mRNA的表达也逐渐减少；其中Tg mRNA的变化最为明显。

2.5左旋甲状腺素钠及丙硫氧嘧啶对姜黄素药效的影响如Tab 3所示，左旋甲状腺素钠(L-T4)较对照组能明显提高小鼠肛温及饮水量(P<0.01)，并伴随着小鼠体重的明显减少(P<0.01)，肛温平均增加1.01℃，每5只小鼠饮水量平均增加9.83 mL，体重变化较对照组平均减少6.32 g；L-T4能明显延长冷冻小鼠的生存时间，生存时间平均增加40 min(Fig 6A)；通过小鼠基础代谢表观可以看出姜黄素与L-T4的药效相同。与对照组相比，L-T4与姜黄素联用后产生协同药效，可明显提高小鼠的基础代谢指标(P<0.01)(Tab 3)，肛温平均增加1.12℃，每5只小鼠饮水量平均增加11.65 mL，体重平均减少6.52 g，延长冷冻小鼠的生存时间20 min(Fig 6A)。

Fig 5 Effect of acute cold exposure under(-20±1) ℃on levels of Tshr, Nis, Tg, Tpo of thyroid tissue(±s，n=12)

与对照组相比，丙硫氧嘧啶(PTU)能明显降低小鼠肛温及饮水量(P<0.01)，伴随着小鼠体重的增长(P<0.01)(Tab 3)，肛温平均减少0.58 ℃，每5只小鼠饮水量平均减少10.17 mL，体重平均增长1.89 g；PTU能明显减少冷冻处理小鼠的生存时间，生存时间平均减少63 min(Fig 6A)，明显降低了血清中FT3、FT4的分泌水平(P<0.01，Fig 6B)，并伴随着Nis、Tpo、Tg、Tshr mRNA表达的明显减少(P<0.01)，其中对Tg mRNA的抑制最为明显(Fig 6C)；如Fig 6D所示，PTU处理后，冷冻处理的小鼠甲状腺结构发生明显改变，甲状腺滤泡有明显肿大，滤泡破坏严重或边界基本消失，增生变化明显，多数滤泡胶质稀薄甚至缺失，滤泡壁上皮细胞明显受压，表明PTU对小鼠甲状腺功能产生明显的抑制作用。PTU与姜黄素联合用药组同姜黄素单独给药组相比，明显降低了小鼠肛温(P<0.01)、饮水量(P<0.01)，并伴随着体重的增加(P<0.01)，肛温平均降低0.67 ℃，每5只小鼠饮水量平均减少12.96 mL，体重平均增加约3.03 g；冷冻处理小鼠生存时间降低，平均减少56 min；血清中FT3、FT4的分泌水平明显降低(P<0.01)，Nis、Tpo、Tg、Tshr mRNA表达明显减少(P<0.05，Fig 6C)，肉眼观察可见甲状腺明显肿大，镜下观察甲状腺组织呈结节状分布，组织内血管增多，滤泡上皮细胞肥大，腔内胶质减少(Fig 6D)；联合给药后，PTU抑制了姜黄素产生的促甲状腺功能作用。

Fig 6 Impact of L-T4 and PTU on curcumin effect(±s,n=12)A:The survival time of mice under(-20±1) ℃; B: The effects of PTU, curcumin and combination of both treatment on thyroid hormone FT3 and FT4 activity in mice after cold treatment; C: The effect of acute cold expose under(-20±1) ℃ on the levels of Tshr, Nis, Tg, Tpo of thyroid tissue; D: Effects of PTU, curcumin and combination of both treatment on thyroid tissue structure after cold treatment in mice.*P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs Cur;ΔP<0.05,ΔΔP<0.01 vs PTU

3 讨论

恒温动物机体对寒冷存在着适应和调节的内在机制，超出机体调节范围会引起机体损伤，低温冷冻损害了心血管系统、中枢神经系统、能量代谢等多个器官与系统，威胁生命安全。冷冻会导致机体的神经内分泌系统持续兴奋，内分泌代谢调控从代偿阶段进入到失代偿阶段，引起机体免疫力的下降、神经损伤等神经内分泌多种病理学变化[1]。甲状腺既是机体对抗低温的重要内分泌器官，也是冷冻损伤的重要靶器官[15]。因此，研究低温冷冻条件下甲状腺的保护与维持内分泌功能是温热药物研究的一个重要目标。如何发掘中药温里药以及寒冷地区民俗中合理的抗寒凉饮食成份成为研究关注的热点。

甲状腺保护药物的研究对预防及治疗甲状腺相关疾病尤为重要。有学者发现[12]，维生素C对由低体温引起的神经传导速率损伤与神经轴索病变可能具有保护作用。近年来，临床上最常用的保护机体能量代谢与消耗的药物，如优甲乐、甲状腺片、生长激素、丙硫氧嘧啶、β受体阻断剂等。当机体甲状腺功能不正常时，这些甲状腺保护药物通过对甲状腺功能的调节来维持机体的能量代谢，但这类药物副作用大、不良反应多、治疗手段繁琐、复发率高，且可能因剂量、作用方式、用药时间的不同加速了甲状腺的损伤。近年来，天然产物多靶点药理学研究、网络药理学研究为小分子天然产物的复杂药理学作用提供了可借鉴的研究方法与数据[11]。由于低温冷冻牵涉到包括中枢神经系统、传出神经系统、内分泌系统、心血管系统等多个系统的复杂作用，姜黄素这种小分子、多靶点的多重药理学研究进展提示其可能存在着对甲状腺功能的影响[2]。

甲状腺激素的调控及甲状腺功能相关基因与机体能量代谢关系密切。本文研究发现，姜黄素能明显延长冷冻处理后小鼠的生存时间，并且发现姜黄素对冷冻处理时小鼠甲状腺的活动有着特殊的敏感性。研究结果表明，姜黄素对冷冻暴露诱导的机体损伤的保护原理是逆转了甲状腺组织的损伤，促使甲状腺组织中甲状腺功能相关基因Tg、Tpo、Nis基因上调，Tshr基因下调，进而增加血清中FT3、FT4的分泌，随即带来了血液中总甲状腺激素水平的增加。Ishido等[13]研究报道，Tg基因的表达对增强甲状腺激素的分泌是必要的，我们研究中也发现姜黄素对Tg mRNA的上调作用最为明显。甲状腺激素分泌的增加可导致体重减轻、体温增加、饮水量增加。姜黄素则通过提高甲状腺激素水平来增加产热与代谢，这即是这些动物实验结束时小鼠肛温、体重与饮水量之间存在差异的原因，这种差异与Mustafa等[14]的研究一致，最终对寒冷暴露后的机体产生了一定的保护价值。

左旋甲状腺素钠(L-T4)作为临床上治疗甲状腺功能减退的代表西药，对甲状腺功能的促进作用已被证明。姜黄素与L-T4的应用都可促进甲状腺的功能，但外源性的激素稍稍使用不当，便会兴奋机体各系统，出现物质、能量代谢亢进[7]。本文研究数据证明优甲乐与姜黄素联合用药时，两者促甲状腺功能的作用产生协同效果，但联合用药组较姜黄素或L-T4单独给药组延长冷冻处理小鼠生存时间明显缩短，联合用药后可能刺激下丘脑-垂体-甲状腺轴的过度兴奋，引起甲状腺激素的分泌失衡，导致机体产热失调，散热加快，加快了死亡，不利于抗寒。本实验过程中，姜黄素单独给药组小鼠并未有上述现象出现，其副作用小、效果最佳。PTU同样作为临床上治疗甲状腺功能亢进的代表西药，能明显抑制甲状腺功能。当PTU与姜黄素联时，本研究发现PTU抑制了姜黄素的促甲状腺功能作用，通过加剧甲状腺组织的损伤，降低Tg、Tpo、Nis、Tshr基因的表达，减少血清中FT3、FT4的分泌，使得总甲状腺激素水平减少，导致机体产热减少不能抵御寒冷，因此，甲状腺功能减退的动物不能适应冷环境，这与计红等[15]报道一致。提示PTU通过抑制姜黄素对甲状腺功能的促进作用，阻断甲状腺激素的合成，进而缩短冷冻小鼠存活时间。

综上所述，姜黄素通过促进甲状腺激素的生成，延长了冷冻处理小鼠的生存时间。本研究首次指出了姜黄素通过提高甲状腺激素水平来增加产热与代谢，并且姜黄素同L-T4的正协同与PTU的负协同作用，说明了姜黄素基于促甲状腺功能对低温冷冻小鼠生存时间的保护机制。本研究观察的姜黄素冷冻保护现象是否存在中枢神经系统、心血管系统的促进作用还需进行后续实验。

(致谢：本研究在石河子大学药学院新疆特种植物药资源教育部重点实验室完成，在此对各位老师和实验室全体同学致以衷心的感谢！)

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Effectofcurcumininprolongingsurvivaltimeofcryopreservedmiceviapromotingthyroidfunction

LI Zhao-xue1,3, HU Si-yuan2, WANG Ji-ye1,3, CHEN Ze-hui1,3, ZHANG Shan-shan1,3, ZHANG Bo1,3
(1.SchoolofPharmaceutics;2.DeptofCardiothoracicSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofShiheziUniversity;3.KeyLabofXinjiangEndemicPhytomedicineResources,MinistryofEducation,ShiheziUniversity,ShiheziXinjiang832002,China)

AimTo look for cold-protective drugs treating cryogenic freezing that may bring great damage to animal physiological system.MethodsThe protective effect of curcumin on frozen damage and the changes of thyroid function in mice were studied in this study. Quantitative analysis of the changes in survival time and metabolic indexes in mice disposed at(-20±1)℃ was conducted. Mouse serum free triiodothyronine(FT3) and free thyroxine(FT4) contents were detected by ELISA kit. HE staining was used to observe thyroid tissue morphological items. The expression of genes related to thyroid function was assessed via real-time quantitative PCR.ResultsThe intraperitoneal injection of curcumin(12.5～50 mg·kg-1) could remarkably prolong the survival time of mice when exposed to cryogenic freezing. HE staining results displayed a recovered thyroid injury in morphology in the curcumin group, further with a notably improved metabolic indexes and evidently increase in serum FT3 and FT4 levels. The real-time quantitative PCR results indicated that the expressions of sodium iodide symporter(Nis), thyroglobulin(Tg) and thyroid peroxidase(Tpo) were up-regulated, and the expression of thyroid-stimulating hormone receptor(Tshr) was down-regulated. Sodium levothyroxine collabrated with the promoting thyroid effects of curcumin, while propylthiouracil inhibited the effects.ConclusionCurcumin can prolong the survival time of the cryogenic freezing mice, which is closely related to its ability to promote thyroid function.

curcumin; cold injury; thyroid; survival time; Kunming mice; propylthiouracil; sodium levothyroxine

时间：2017-8-20 16:47 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170820.1647.040.html

2017-04-26,

2017-05-24

国家自然科学基金资助项目(No 81460566，U1603122)

李照雪(1992-)，女，硕士生，研究方向：中药药理学和系统生物学，E-mail：605576076@qq.com； 张 波(1978-)，男，博士，教授，研究方向：系统药理学与中药药理学，通讯作者，E-mail：bozhang_lzu@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.09.020

A

：1001-1978(2017)09-1291-07

R-332；R282.71；R322.51；R347.2；R645；R977.14