响应面法优化岭南炮天雄生物碱提取工艺

覃军　邓广海　陈艳红

[摘要] 目的 优化岭南特色饮片炮天雄总生物碱的提取工艺。 方法 采用响应面分析法，依据Box-Behnken原理优化炮天雄乙醇超声提取工艺，实验以总生物碱提取率为评价指标，考察提取时间、乙醇浓度、液料比等主要影响因素，最终得出炮天雄最佳提取工艺。 结果 炮天雄总生物碱最佳提取工艺为乙醇比例75%，液料比8.0，提取时间30 min，在此条件下，总生物碱提取率理论值为31.1%，实际值为32.5%。 结论 基于响应面法优化的参数条件具有较高的实用价值，可为岭南特色炮天雄的开发利用提供参考依据。

[关键词] 炮天雄；响应面法；总生物碱；工艺优化

[中图分类号] R961 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）07（a）-0031-04

[Abstract] Objective To optimize extraction process of total alkaloids from Lingnan featured pieces Paotianxiong by response surface method. Methods Three-variables as extraction time， ratio of material to solution and ethanol concentration， and three-levels Box-Benhnken experimental design was used to optimize the effects of independent variables on the total alkaloid extraction efficiency. Results The optimum conditions were extraction time 30 min， ratio of material to solution 8.0， and 75% ethanol concentration. Under the optimum conditions， the theoretical total alkaloid extraction rate was 31.1%， and the actual rate was 32.5%. Conclusion Response surface method is an effective methodology to optimize the total alkaloid extraction process of Lingnan featured pieces Paotianxiong.

[Key words] Paotianxiong； Response surface method； Total alkaloid； Process optimization

附子为毛茛科植物乌头（Aconitum carmichaeli debx.）的子根，传统中医认为子根中独生个大者称之为天雄[1]，岭南地区根据传统用药习惯，采用传统炮制技术将其加工成独具岭南特色炮制品，习称炮天雄[2]。炮天雄在岭南地区具有广泛临床应用基础，在港澳、东南亚地区，炮天雄常作为滋补食疗上品，用于治疗元阳素虚、肾亏阳虚证患者[3-5]。现代研究表明，炮天雄富含生物碱类成分[6-8]，这类成分为炮天雄的主要药效成分，因此从炮天雄分离提取生物碱类成分具有较高的现实意义。目前，嶺南特色炮天雄生物碱成分提取工艺的研究未见报道。响应面法（RSM）是一种优化多变量体系的有效实验工具，采用多元二次回归方程来拟合多个因素与响应值之间、因素与因素之间的函数关系，找出各因素的最佳组合和响应值的最优值，有效地解决多变量问题[9-12]。由于响应面分析法在优化研究中具有实验次数少、精确度高、成本低、产出高等优点，已被广泛用于生物、化学、食品、医药等领域[13-16]。本实验采用响应面方法，以总生物碱提取率为响应值，考察不同提取时间、乙醇分数、液料比等主要提取因素及它们的相互作用对总生物碱提取率的影响，优化炮天雄提取工艺。

1 材料

KQ-2200B型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BS110S型电子天平（赛多利斯有限公司）；HWS28型恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）；炮天雄饮片（批号：YPA00001）购于广州市药材公司，经广东省中医院林华主任中药师鉴定为毛茛科植物乌头（Aconitum carmichaeli debx.）的干燥根的炮制品。乙醇、氯仿等试剂均为分析纯（广州化学试剂厂），水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液制备

取样品粉末（过三号筛）100 g，精密称定，按照响应面设计方案进行提取，回收提取液，浓缩，用1%盐酸水溶剂定容至含药材0.5 g/mL供试品液，2℃保存备用。

2.2 总生物碱测定

参照2010版《中国药典》[17]一部附子项下总生物碱含量测定及相关文献，采用滴定法测定炮天雄总生物碱含量。

2.3 响应面实验设计

实验在单因素实验的基础上，对炮天雄乙醇超声提取工艺中乙醇体积、固液比、提取时间等主要影响因素进行考察，每个因素设定3个水平，以总生物碱提取率为响应值，采用Design-Expert 8.0.6软件设计三因素三水平响应面分析实验[18-19]。实验因素及水平见表1。

实验采用Box-Behnken设计，选取提取乙醇体积分数（A）、提取液料比（B）、提取时间（C）三因素三水平对总生物碱提取率的影响。实验按照Design-Expert设计方案设计了15个实验点，每个实验点平行分析3次，结果见表2。15个实验点可分为2类，包括12个析因点和3个零点重复实验。

通过对响应面实验结果进行分析，利用Design-Expert软件对上述实验结果进行二次回归拟合后，得到3个因素与炮天雄生物碱含量之间的模拟方程为：Y = 29.03+4.15A+0.62B+2.98C-0.35AB-0.95AC-1.20BC-2.17A2-3.32B2-2.62C2。

为考察回归方程的有效性及各因素对总生物碱提取率的影响程度，对上述回归方程进行方差分析，结果见表3。由此可看出，该回归模型的F检验为极显著（P < 0.01），其失拟项为不显著（P > 0.05），表明该二次多项模型可以较好地描述各因素与响应值的真实关系，可用于总生物碱最佳提取工艺的筛选。该回归方程的相关系数为R2 = 0.9657，即96.57%的数据可用该模型解释，方程拟合度良好。单因素A、C及二次项A2、B2、C2对响应值有显著影响（P < 0.05），其中单因素A、C和二次项A2、C2对响应值有极其显著影响（P < 0.01）。

2.4 响应面优化工艺分析

为了进一步研究各因素之间的交互关系，采用Design-Expert软件模拟了3种影响因素对总响应因子交互影响的3D响应曲面图和等高线图（图1～3），分别将其中1个因素固定在零水平，考察另外两个因素之间的交互影响。在等高线图中，圆形表示两因素交互作用不显著，椭圆形表示两因素交互作用显著，在响应曲线图中，曲线走势越陡，其影响越显著，曲线走势越平滑，其影响越小。

乙醇体积分数比和液料比对炮天雄总生物碱提取率的影响见图1，在提取时间固定为零水平（30 min）时，乙醇体积分数对炮天雄生物碱提取率影响显著，随着乙醇浓度增加而逐步增加，在乙醇浓度40%～70%时增加尤为明显，液料比的曲线较为平缓，在1∶9附近达到最高点，表明其对提取率影響相对较小。等高线图表明两者交互对提取率影响不显著。

固定液料比为1∶8时，乙醇体积分数和提取时间对生物碱提取率的影响见图2。从图2A可知，乙醇体积分数、提取时间对提取率影响较为显著，生物碱提取率随着乙醇浓度和提取时间的增加而增加，其增幅逐步收窄。从3D曲线图的曲面分析和高线图直观分析，可见两者交互影响比较明显。

固定乙醇体积分数为60%时，液料比与提取时间对生物碱提取率的影响见图3。从3D曲面图直观分析可知，提取时间对生物碱提取率影响较大，而液料比影响因素相应的曲线较为平缓。两者的交互作用也不明显。

根据Design-Expert 8.0.6软件对实验结果进行最优化分析，确定最佳提取的生物碱提取条件为乙醇比例76.6%，液料比8.0，提取时间30.7 min，在此条件下生物碱的理论提取率为31.1%。

2.5 工艺验证

采用模型预测的结果进行验证实验，考虑到实际应用情况，定义修正后的最优提取条件为乙醇比例75%，液料比8.0，提取时间30 min，按此工艺提取3次，得到生物碱平均提取率为32.5%，略高于理论值31.1%。

3 讨论

本研究在单因素实验的基础上，通过响应面分析法优化岭南特色药材品种炮天雄的总生物碱提取工艺最佳条件为乙醇比例76.6%，液料比8.0，提取时间30.7 min。根据实际情况修订提取参数为乙醇比例75%，液料比8.0，提取时间30 min。在此条件下得到生物碱最佳提取率为32.5%，与理论值31.1%相近，表明采用响应面法优化得到的生物碱提取参数条件可靠，可为炮天雄生物碱提取扩大化生产和综合利用提供了实验参考和依据。

过往的研究较多采用单因素考察法和正交实验方法优选总生物碱提取效率[20]。与正交实验方法相比，响应面法通过构建二次回归数学模型，能分析多因素干扰下实验设置水平之外的最佳水平组合。但响应面法优化的前提是，对设计实验点应包括最佳实验条件在内，如实验设计点选取不当，很难得到最优化的结果。纵然如此，响应面法不失为研究多因素问题的有效工具。本文通过响应面方法技术应用，为更多中药及相关研究工作者利用该技术方法，有效解决工作中的方法设计等问题提供研究思路和应用案例。

[参考文献]

[1] 谢晓芳，李梦婷，代良萍，等.附子保健品刨附片及炮天雄的急性毒性研究[J].中国民族民间医药，2014，23（20）：18-19.

[2] 覃军，邓广海，陈艳红，等.不同产地炮天雄的质量考察与比较[J].中国药业，2017，26（3）：11-14.

[3] 曹晖，王春燕，王孝涛.毒性中药天雄炮制历史沿革研究[J].中国中药杂志，1998，23（6）：348-350.

[4] 李德斌，黄志芳，刘云华，等.炮天雄质量标准研究[J].中国实验方剂学杂志，2013，23（19）：146-150.

[5] 曹晖.香港市售乌头类药材及其炮制品的乌头碱含量测定[J].中国中药杂志，1993，18（5）：279-281.

[6] 覃军，龚又明，郑显辉，等.岭南特色炮天雄和传统炮附片的成分比较[J].新中医，2016，12（48）：220-223.

[7] 陈荣昌，孙桂波，张强，等.附子毒性研究进展[J].中国中药杂志，2013，38（8）：1126-1129.

[8] 林彦君，游宇，季宁平，等.HPLC-Q-TOF/MS指纹技术对比分析附子配伍炙甘草前后化学组分变化[J].中草药，2014，45（11）：1556-1560.

[9] 林建原，季丽红.响应面优化银杏叶中黄酮的提取工艺[J].中国食品学报，2013，2（13）：83-90.

[10] 俞娟，刘劲松，王刚，等.响应面法优化马兰多糖提取工艺研究[J].中成药，2015，37（1）：222-225.

[11] 王永菲，王成国.响应面法的理论与应用[J].中央民族大学学报：自然科学版，2005，14（3）：236-240.

[12] 牟会荣，陈昆，王晓岚，等.正交实验法与响应面法在桑叶黄酮提取工艺优化中的应用和比较[J].江苏科技大学学报：自然科学版，2016，30（1）：88-93.

[13] 余香，龚千锋，叶耀辉，等.响应面分析法优选大蓟炮制工艺[J].中国药学杂志，2012，47（24）：1983-1986.

[14] 魏海柳，李琳，马明松，等.响应面法优化水提白附片中的总生物碱[J].现代食品科技，2012，3（28）：309-312.

[15] 邢海丽，辛嘉英，王艳，等.响应面优化甲烷氧化菌素、苯甲酸钠和山梨酸钾复配剂抑菌效果[J].食品科学，2016，37（18）：1-5.

[16] 千春录，侯顺超，殷健东，等.响应面实验优化水芹黄酮超声波辅助提取工艺及其抗氧化性[J].食品科学，2016， 37（10）：76-81.

[17] 国家药典委员会.中国药典[S].二部.北京：化学工业出版社，2010：177-178.

[18] 单鸣秋，钱岩，于生，等.基于响应面法的天麻产地加工炮制一体化工艺研究[J].中草药，2016，47（3）：420-424.

[19] 阙淼琳，蒋玉蓉，曹美丽，等.响应面实验优化藜麦种子多酚提取工艺及其品种差异[J].食品科学，2016，37（4）：7-12.

[20] 刘卓，晏星，徐春霞，等.附子总生物碱的提取工艺研究[J].安徽农业科学，2012，40（9）：5199-5201.

（收稿日期：2017-03-14 本文编辑：李亚聪）