贝加尔唐松草内生真菌次级代谢产物抑菌活性研究

马建苹，康银霞，郭 涛，李善家，晋 玲

（1兰州理工大学生命科学与工程学院，兰州730050；2甘肃省中藏药筛选评价及深加工重点实验室，兰州理工大学，兰州 730050；3甘肃中医药大学药学院，兰州730000）

贝加尔唐松草内生真菌次级代谢产物抑菌活性研究

马建苹*，康银霞1,2，郭 涛1,2，李善家1，晋 玲3

（1兰州理工大学生命科学与工程学院，兰州730050；2甘肃省中藏药筛选评价及深加工重点实验室，兰州理工大学，兰州 730050；3甘肃中医药大学药学院，兰州730000）

目的 研究贝加尔唐松草植物内生真菌次级代谢产物抑菌活性。方法 用微量肉汤稀释法测定贝加尔唐松草内生真菌发酵产物的最低抑菌浓度(MICs)。结果18株内生真菌的乙醇提取物、乙酸乙酯和正丁醇萃取物中，Z-1的乙酸乙酯部位抑菌活性最强，对金黄色葡萄球菌和地衣芽孢杆菌的MIC值为125μg/mL，对肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、无乳链球菌、铜绿假单胞菌的MIC值均为250μg/mL，菌株Z-3和Z-4的正丁醇部位抑菌活性较好，对6株供试菌的MIC值都达到250μg/mL；乙醇部位抑菌活性较弱。结论 贝加尔唐松草内生真菌的次级代谢产物具有抑菌活性，为进一步阐明其药效物质基础奠定基础。

贝加尔唐松草；内生真菌；次级代谢产物；抑菌活性

贝加尔唐松草(Thalictrum baicalense Turcz)为毛茛科(Ranunculaceae)唐松草属(Thalictrum)植物，多年生草本植物，别名马尾黄连、土黄连等。以根及根茎入药，有抗菌消炎、清热燥湿、凉血解毒、清心除烦之功效，具有抗癌、降压、利尿、抗心律失常等药理作用，主要用于治疗痢疾、肠炎、湿热黄疸、传染性肝炎、咽喉肿痛、疮疖、脚癣等症[1-2]。据研究报道，药用植物内生真菌的次生代谢产物可以产生抗生素类物质，对多种病原微生物具有一定的抑制活性，约有30%的内生真菌具有抗细菌和抗真菌活性[3]，有望成为临床抗菌类药物和研究与开发生物农药的新资源。如Dai[4]等从刺柏属植物雪松(Juniperuscedre)中分离得到多节孢属(Nodulisporium sp)内生真菌，其发酵产物乙酸乙酯部位共分离得到17种化合物，其中的12种化合物均表现出了很好的抗真菌和细菌活性。有研究表明唐松草属植物生物碱具有抗菌活性[5]，但关于贝加尔唐松草内生真菌的研究国内外鲜有报道，鉴于药用植物及其内生真菌的重要价值，本研究对贝加尔唐松草内生真菌的次级代谢产物进行抑菌活性研究。

1.材料

1.1 实验材料及仪器

实验所用18株植物内生真菌均由本研究室提供。紫外分光光度计、电子分析天平、电热恒温干燥箱、超净工作台、旋转蒸发器、恒温振荡培养箱、实验型高压灭菌锅等均为常用仪器；实验所用药品试剂均为国产分析纯。

1.2 供试菌株

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)均由兰州理工大学生命科学与工程学院实验中心提供。

2.实验方法

2.1 内生真菌的发酵培养及供试样品的制备

将保存于斜面培养基中的内生真菌菌株挑取少许在培养基平板上画线活化1～2次，活化好的菌株挑取适量接种于液体培养基中，28℃、160r/min培养7d，待菌株成熟后，液体培养基用布氏漏斗抽滤，分别得到滤液和菌丝体。滤液加入等体积的乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，各萃取3次，合并每次萃取液，减压蒸干，得到发酵液乙酸乙酯和正丁醇萃取部位；固体菌丝冷冻干燥后用乙醇回流提取，回流2～3h，提取液减压蒸干得菌丝乙醇提取部位。

2.2 MIC值测定

精确称量待测样品6.0mg，加入150μL的DMSO充分溶解，再加入1350μL的MH肉汤，使样品的最初浓度为4000μg/mL，然后采用二倍稀释法，用MH肉汤依次稀释成浓度为2000，1000，500，250，125μg/mL的样品备用。在96孔平底微孔板中依次加入100μL的MH肉汤，50μL梯度稀释的样品，50μL0.5麦氏浓度的菌液，使待测样品的终浓度分别为1000，500，250，125，62.5，31.25μg/mL[5-6]。阴性对照组用50μL1%DMSO的肉汤培养基，阳性对照为50μL20μg/mL硫酸链霉素。37℃培养箱静置培养12-18h，然后每孔加入50μL100μg/mL INT（碘硝基四唑紫）显色剂，30min后观察颜色变化，以没有显示红色的最低浓度作为该样品对某一细菌的最小抑制浓度(MIC)。

3.结果

本实验采用微量肉汤稀释法对贝加尔唐松草内生真菌次级代谢产物进行抑菌活性测定和筛选，阳性对照硫酸链霉素在20μg/mL时对所有供试菌都有抑制活性，阴性对照组样品均显红色，表明抑菌试验模型良好，有抑菌活性的样品结果见表1。从表1可以看出，菌株Z-1的乙酸乙酯部位抑菌活性最好，对金黄色葡萄球菌和地衣芽孢杆菌的MIC值为125μg/mL，对肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、无乳链球菌、铜绿假单胞菌的MIC值均为250μg/mL；菌株Z-3和Z-4的正丁醇部位抑菌活性较好，对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、无乳链球菌、地衣芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的MIC值都达到250μg/mL；菌株Z-7乙醇部位抑菌活性较好，其对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌的MIC值都达到250μg/mL、对无乳链球菌、地衣芽孢杆菌的MIC值为1000μg/mL，其他菌株活性整体较弱或者在样品浓度在1000μg/mL时无明显抑菌活性。

表1 贝加尔唐松草内生真菌次级代谢产物的最低抑菌浓度(MIC,μg/mL)

注：G-根；Y-叶；J-茎；Z-种子；a-乙酸乙酯；b-正丁醇；c-乙醇

4.结论

目前，虽然有多种方法检测样品的抗菌活性，但不同方法存在灵敏性、重复性和准确性等差异，没有一个绝对的标准，陈秀枢等对微量肉汤稀释法测定MIC值进行了评价，结果表明传统琼脂稀释法和试管肉汤稀释法既烦琐，准确度又不高，一直难以将其作为常规药敏试验，临床广泛采用的是对MIC范围作定性解释的纸片扩散法，然而该法又不可避免地存在许多局限性，如受到菌厚度和培养基厚度的影响等，实验的准确性相应受到影响，因此，具有简便性和良好的方法学性能的微量肉汤稀释法测定MIC值，具有临床推广应用价值，更适于检测样品的抗菌活性。Eloff[8]等对微量肉汤稀释法进行了改进，开发使用96孔微量培养板，并用INT（碘硝基四唑紫）显色剂来说明细菌的生长状况，增强了实验的灵敏性和可重复性。本实验采用微量肉汤稀释法对贝加尔唐松草内生真菌次级代谢产物进行抑菌活性分析，抑菌活性物质主要集中于发酵液的乙酸乙酯部位。Z-1发酵液的乙酸乙酯部位抑菌活性最好，其对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、无乳链球菌、地衣芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌均有抑制活性。发酵液正丁醇部位和菌丝体乙醇提取部位抑菌活性较弱，大多数样品在1000μg/mL时，对所有菌株没有表现出明显的抑制活性。后续将进一步阐明其抑菌药效物质基础，为当地药用植物资源的综合开发利用提供理论支撑。

[1]杨永健, 丁博儒, 贺朝旭.唐松草野生变家种的初步研究[J].西北植物学报, 1997, 17(6): 119-121.

[2]张永红.抗癌植物唐松草研究概况[J].西北民族学院学报(自然科学版), 1996, 17(1): 85-88.

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[4] Dai J, Krohnk, Florke U, et al.Metabolites from the endophytic fungus Nodulisporium sp.from Juniperus

cedre[J].European Journal of Organic Chemistry, 2006, 2006(15):3498-3506.

[5]朱敏, 肖培根.中国唐松草属植物的化学系统学初探[J].植物分类学报, 1991, 29 (4): 358-369.

[6] 许颖, 郭婧玉, 刘学, 等.飞龙掌血乙醇提取物对白色念珠菌抑菌作用的研究[J].中国实验方剂学杂志, 2012, 18(10): 270-274.

[7] Eloff J N.A Sensitive and Quick Microplate Method to Determine the Minimal Inhibitory Concentration of Plant Extracts for Bacteria[J].Planta Med, 1998, 64(08): 711-713.

[8]陈秀枢, 屠湧涛.微量肉汤稀释法测定MIC的评价[J].临床微生物学, 1994, 17(2):95-98.

甘肃省自然科学基金（No.1606RJZA207）