膝痹消熏洗颗粒药效学研究*
2017-08-16亮郭剑华刘渝松李卿马善治王健谢
郭 亮郭剑华刘渝松李 卿马善治王 健谢 辉
(1.重庆市中医骨科医院,重庆 400010;2.重庆市中药研究院,重庆 400065)
·研究报告·
膝痹消熏洗颗粒药效学研究*
郭 亮1郭剑华1刘渝松1李 卿2马善治1王 健1谢 辉1
(1.重庆市中医骨科医院,重庆 400010;2.重庆市中药研究院,重庆 400065)
目的观察膝痹消熏洗颗粒的药效学作用。方法给大鼠涂抹膝痹消熏洗颗粒,以大鼠急性抗炎镇痛和急性血瘀为模型,观察其药理作用。结果膝痹消熏洗颗粒高剂量组(16.0mg生药/cm2)对棉球肉芽肿增生程度、二甲苯所致小鼠耳肿胀以及冰醋酸所致小鼠扭体反应有明显的抑制作用,同时对二甲苯所致小鼠皮肤毛细血管通透性增高有明显的抑制作用,并且能明显降低大鼠的全血黏度、血浆黏度及高切还原黏度的作用。结论膝痹消熏洗颗粒对急性炎症有较强的抗炎镇痛作用,同时还具有一定活血化瘀作用。
膝痹消熏洗颗粒 药效学
膝痹消熏洗颗粒是临床上膝痹病的外用熏洗经验方,通过优化处方和剂型改良为外用熏洗颗粒,其功能主治为活血化瘀、通调气血、祛风祛湿、消肿止痛,临床用于治疗膝关节骨性关节炎。本研究拟通过动物试验,观察膝痹消熏洗颗粒抗炎镇痛和活血化瘀的药理作用,为临床用药提供参考依据。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物
KM小鼠,SPF级,雌雄各半,体质量18~22 g,中国人民解放军第三军医大学实验动物中心提供。实验动物生产许可证号:SCXK(军)2012-0011。动物合格证号:0020231。KM小鼠,SPF级,雌雄各半,18~22 g,由重庆市中药研究院实验动物研究所提供,实验动物生产许可证号SCXK(渝)2012-0006,动物合格证号0002231。SD大鼠,SPF级,雌雄各半,体质量120~160 g,由重庆市中药研究院实验动物研究所提供,实验动物生产许可证号SCXK(渝)2012-0006,动物合格证号0002221。SD大鼠,SPF级,雌雄各半,体质量200~260 g,由中国人民解放军第三军医大学实验动物中心提供,实验动物生产许可证号SCXK(军)2012-0011,动物合格证号0020251。
1.2 药物与试剂
冰醋酸:重庆川东化工(集团)有限公司化学试剂厂生产,批号20150901。0.9%氯化钠注射液:太极集团西南药业股份有限公司生产,批号16041016。戊巴比妥钠:SIGMA公司生产,批号908M031。注射用青霉素钠:太极集团西南药业股份有限公司,批号151007。二甲苯:重庆川东化工 (集团)有限公司生产,批号20131101。丙酮:重庆川东化工(集团)有限公司生产,批号20150501。依文思兰:北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司生产,批号111D0316。硫酸钠:重庆川东化工(集团)有限公司生产,批号20150101。氯化钠:重庆川东化工(集团)有限公司生产,批号20150501。盐酸肾上腺素注射液:重庆迪康长江制药有限公司生产,批号160801。HCT:济南希森美康医用电子有限公司生产,批号G5365。膝痹消熏洗颗粒:由重庆市中药研究院药化研究所提供,每毫升相当于2.4 g药材,批号160602。双氯芬酸二乙胺乳胶剂(扶他林):北京诺华制药有限公司生产,批号VP0345。EDTA一次性真空采血管:河北鑫乐医疗器械科技股份有限公司生产,批号16109002。肝素钠一次性真空采血管:河北鑫乐医疗器械科技股份有限公司生产,批号16078802。
1.3 仪器与设备
UW-4200S电子天平:岛津国际贸易有限公司生产。BSA3202S电子天平:赛多利斯科学仪器(北京)有限公司生产。BS224S电子天平:北京赛多利斯仪器系统公司生产。Allegra X-12离心机:美国贝克曼库尔特有限公司生产。FASCO-3010B全自动血液流变快测仪:重庆大学维多生物工程研究所提供。756PC型紫外可见分光光度计:上海舜宇恒平科学仪器有限公司生产。XT-2000i全自动动物血液分析仪:日本希森美康株式会社生产。LDZM50立式压力蒸汽灭菌器:上海申安医疗器械厂。
2 方法与结果
2.1 膝痹消熏洗颗粒抗炎镇痛作用[1-5]
2.1.1 各组对大鼠棉球肉芽肿增生的影响 1)实验方法。SD大鼠50只,雌雄各半,待检疫及适应饲养期结束后,采用随机区组法(以体质量为主要关键字、随机数字为次要关键字)分为5组,每组10只,即溶媒对照组(纯化水)、膝痹消熏洗颗粒高、中、低剂量组(16.0、8.0、4.0 mg生药/cm2)和阳性对照组(双氯芬酸二乙胺乳胶剂0.5mg/cm2)。各组于给药前1 d备皮,用6%的硫化钠脱毛剂将动物背部脊柱两侧毛发脱去,去毛范围约4 cm×10 cm。将各样品均匀涂抹于整个脱毛区,在上面用二层灭菌纱布覆盖 (溶媒对照品用灭菌纱布吸附后贴敷于脱毛区),再用胶布固定,6 h后,去除覆盖物,用温水去除残留的各样品。给药体积为2.0mL/只,每日1次,连续7次。SD大鼠分组后腹腔注射45mg/kg戊巴比妥钠麻醉,在每只大鼠的左右蹊部用碘酊消毒,75%酒精棉球脱碘后,切1 cm切口,用眼科镊子将20 mg的高压灭菌棉球 (经氨苄青霉素0.2 mL浸泡、烘干),从切口处分别植入左右皮下,随即缝合皮肤。从手术当日开始记做给药第1天,连续给药7 d。第8日,动物麻醉后,打开原切口,将棉球连同周围结缔组织一起取出,剔除脂肪组织后,以70℃烘干并称质量。将称得的质量剪去棉球原质量,即肉芽肿质量,比较各组肉芽肿质量差异。2)结果。见表1。与溶媒对照组比较,膝痹消熏洗颗粒高剂量组的肉芽肿增生程度明显降低(P<0.01),提示膝痹消熏洗颗粒对炎性增生有明显的抑制作用。
2.1.2 各组对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 1)实验方法。KM小鼠50只,雌雄各半,随机分为5组,每组10只,即溶媒对照组、膝痹消熏洗颗粒高、中、低剂量组(16.0、8.0、4.0 mg生药/cm2)、阳性对照组(双氯芬酸二乙胺乳胶剂0.4mg/cm2)。各组于给药前1 d备皮,用6%的硫化钠脱毛剂将动物背部脊柱两侧毛发脱去,去毛范围3 cm×3 cm。将各样品均匀涂抹于整个脱毛区,在上面用二层灭菌纱布覆盖 (溶媒对照品用灭菌纱布吸附后贴敷于脱毛区),再用胶布固定,6 h后,去除覆盖物,用温水去除残留的各样品。给药体积均为0.4mL/只,每日1次,连续给药5 d。末次给药后1 h,于小鼠右耳涂抹二甲苯0.02mL/只,20min后脱颈处死动物,打孔器打下动物左右耳,精密称取耳片质量,计算耳肿胀度(右耳质量-左耳质量),耳肿胀抑制率=(溶媒对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/溶媒对照组平均肿胀度×100%。2)结果。见表2。与溶媒对照组相比,膝痹消熏洗颗粒高、中剂量组的肿胀度明显降低(P<0.05),提示膝痹消熏洗颗粒对二甲苯所致小鼠耳肿胀有明显的抑制作用。
表1 各组对大鼠棉球肉芽肿增生的影响(mg,±s)
表1 各组对大鼠棉球肉芽肿增生的影响(mg,±s)
与溶媒对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。下同。
组 别 剂量(mg生药/cm2) n 肉芽肿(mg)溶媒对照组 / 10 89.62±5.86阳性对照组 0.5 10 51.74±5.60**高剂量组 16.0 10 67.85±9.47**中剂量组 8.0 10 80.70±8.54低剂量组 4.0 10 81.00±11.71
表2 各组对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响
2.1.3 各组对小鼠镇痛作用的影响(扭体法) 1)实验方法。KM小鼠50只,雌雄各半,随机分为5组,每组10只,即溶媒对照组、膝痹消熏洗颗粒高、中、低剂量组(16.0、8.0、4.0 mg生药/cm2)、阳性对照组(双氯芬酸二乙胺乳胶剂0.4mg/cm2)。各组于给药前1 d备皮,用6%的硫化钠脱毛剂将动物背部脊柱两侧毛发脱去,去毛范围3 cm×3 cm。将各样品均匀涂抹于整个脱毛区,在上面用二层灭菌纱布覆盖(溶媒对照品用灭菌纱布吸附后贴敷于脱毛区),再用胶布固定,6 h后,去除覆盖物,用温水去除残留的各样品。给药体积均为0.4mL/只,每日1次,连续给药5 d。末次给药后1 h,各组小鼠均腹腔注射0.8%冰醋酸0.2mL/只,记录注射冰醋酸后20 min内小鼠出现扭体反应(腹部内凹,伸展后肢,臀部抬高)的次数及潜伏期,并计算扭体抑制率(%)=(对照组平均扭体次数-给药组平均扭体次数)/对照组平均扭体次数×100%。2)结果。见表3。与溶媒对照组相比,膝痹消熏洗颗粒高、中剂量组的扭体潜伏期明显延长,扭体次数明显减少(P<0.05或P<0.01),提示膝痹消熏洗颗粒对冰醋酸所致小鼠扭体反应有明显的抑制作用,镇痛效果明显。
表3 各组对小鼠镇痛作用的影响(扭体法)(±s)
表3 各组对小鼠镇痛作用的影响(扭体法)(±s)
组 别 剂量(mg生药/cm2)n溶媒对照组 / 10阳性对照组 0.4 10高剂量组 16.0 10中剂量组 8.0 10低剂量组 4.0 10潜伏期(s)扭体次数(次)3.81±0.80 22.52±11.20 9.62±4.21**3.90±3.80**7.21±3.52**11.31±8.72*6.51±3.40**12.10±8.34*4.82±2.16 16.83±8.12抑制率(%)/ 82.71 49.82 46.20 25.32
2.2 膝痹消熏洗颗粒活血化瘀作用[6-8]
2.2.1 各组对二甲苯所致小鼠皮肤毛细血管通透性增高的影响 1)实验方法。KM小鼠50只,雌雄各半,随机分为5组,每组10只,即溶媒对照组、膝痹消熏洗颗粒高、中、低剂量组(16.0、8.0、4.0 mg生药/cm2)、阳性对照组(双氯芬酸二乙胺乳胶剂0.4 mg/cm2),各组于给药前1 d备皮,用6%的硫化钠脱毛剂将动物背部脊柱两侧毛发脱去,去毛范围3 cm×3 cm,同时将小鼠腹部正中部位备皮,去毛范围2 cm×2 cm。将各样品均匀涂抹于整个背部脱毛区,在上面用二层灭菌纱布覆盖(溶媒对照品用灭菌纱布吸附后贴敷于脱毛区),再用胶布固定,6 h后,去除覆盖物,用温水去除残留的各样品。给药体积均为0.4mL/只,每日1次,连续给药3 d。末次给药后1 h于小鼠尾静脉注入0.5%的伊文思蓝生理盐水溶液(0.1mL/10 g体质量 ),随即于小鼠腹部正中去毛部位正中滴二甲苯30μL/只,20 min后小鼠脱颈椎处死,剥下腹部皮肤,翻转后贴于盘上,根据各蓝斑的颜色深浅将其分为10个级别,1个级别记1分。记好评分后,将每块皮肤用手术剪剪碎,投入具塞玻璃试管内,倒人丙酮-硫酸钠溶液10 mL,于暗处放置,每日轻轻摇动该试管2~3次,3 d后2000 r/min离心10 min,取上清液于590 nm处测定吸光度(OD值),以未浸泡皮肤的丙酮-硫酸钠溶液校零,计算抑制率。抑制率=(对照组平均OD值-给药组平均OD值)/对照组平均OD值×100%。2)结果。见表4。与溶媒对照组比较,膝痹消熏洗颗粒各剂量组的皮肤蓝斑色泽深浅评分 (级)和吸光度值均有明显下降(P< 0.01),提示膝痹消熏洗颗粒对二甲苯所致小鼠皮肤毛细血管通透性有明显的抑制作用。
表4 各组二甲苯致小鼠皮肤毛细血管通透性的影响(±s)
表4 各组二甲苯致小鼠皮肤毛细血管通透性的影响(±s)
组 别 剂量(mg生药/cm2)n溶媒对照组 / 10阳性对照组 0.4 10高剂量组 16.0 10中剂量组 8.0 10低剂量组 4.0 10蓝斑色泽(级) OD值9.32±0.80 0.579±0.039 2.51±1.04**0.286±0.053**2.91±1.23**0.304±0.049**4.86±0.61**0.414±0.041**6.73±0.80**0.470±0.045**抑制率(%)/ 73.12 68.84 48.40 28.00
表5 各组对急性血瘀模型大鼠血液流变学的影响(±s)
表5 各组对急性血瘀模型大鼠血液流变学的影响(±s)
高切(200/s) 中切(30/s) 低切(3/s)溶媒对照组 / 10 4.97±0.61**6.29±0.74**12.54±1.07**0.77±0.09**0.40±0.02 11.81±1.71**14.96±2.05**29.69±4.14**14.87±1.66**?组别 剂量(mg生药/cm2) n全血黏度 血浆黏度(mpas·s)红细胞压积(L/L)高切还原黏度中切还原黏度低切还原黏度红细胞刚性指数模型组 / 10 8.04±1.47 9.58±1.62 15.57±1.57 1.34±1.19 0.39±0.02 17.95±3.43阳性对照组 0.5 10 5.21±0.60**6.37±0.73**12.24±0.99**0.98±0.30 0.38±0.02 11.03±1.51**21.89±3.79 37.23±3.92 19.91±4.07 14.07±1.82**29.51±2.60**11.86±2.68**高剂量组 16.0 10 6.24±0.78**7.78±1.05*13.93±1.45*1.32±0.26*0.39±0.02 14.37±2.14*18.49±3.80 33.80±4.07 17.54±3.36中剂量组 8.0 10 7.77±0.64*9.03±0.84 15.37±1.21 1.18±0.20*0.38±0.01 17.54±3.15 21.50±3.77 37.19±2.96 19.66±3.23低剂量组 4.0 10 7.96±0.56 9.52±0.56 15.51±0.91 1.25±0.19 0.39±0.02 18.04±2.56 21.84±3.26 37.35±2.69 19.80±3.10
2.2.2 各组对急性血瘀模型大鼠血液流变学的影响1)实验方法。SD大鼠60只,雌雄各半,待检疫及适应饲养期结束后,随机分为6组,每组10只,即溶媒对照组、模型组、膝痹消熏洗颗粒高、中、低剂量组(16.0、8.0、4.0mg生药/cm2)和阳性对照组(双氯芬酸二乙胺乳胶剂0.5mg/cm2)。各组于给药前1 d备皮,用6%的硫化钠脱毛剂将动物背部脊柱两侧毛发脱去,去毛范围约为4 cm×10 cm。将各样品均匀涂抹于整个脱毛区,在上面用2层灭菌纱布覆盖 (溶媒对照品用灭菌纱布吸附后贴敷于脱毛区),再用胶布固定,6 h后,去除覆盖物,用温水去除残留的各样品。给药体积为2.0mL/只,每日1次,连续7次。末次给药后1 h,除溶媒对照组外,其余各组均按0.08mL/100 g体质量皮下注射0.1%的盐酸肾上腺素注射液,2 h后将动物置于4℃冰水中浸泡5 min,于首次注射后4 h再次给予同等剂量相同途径的盐酸肾上腺素注射液,禁食不禁水18 h。次日取血测定红细胞压积(HCT),再分别用1%肝素抗凝的试管采血,肝素抗凝血测定全血黏度,再将血离心,测定血浆黏度。2)结果。见表5。与溶媒对照组比较,模型组大鼠全血黏度,血浆黏度,高、中、低切还原黏度和红细胞刚性指数均明显升高(P<0.01)。与模型组比较,膝痹消熏洗颗粒高剂量组能明显降低大鼠的全血黏度、血浆黏度及高切还原黏度(P<0.05);中剂量组亦明显降低大鼠的全血黏度(高切)和血浆黏度(P< 0.05)。提示痛膝痹消熏洗对大鼠急性血瘀模型有一定的活血化瘀作用。
3 讨 论
膝痹消熏洗颗粒是郭剑华主任中医师所创的经验熏洗方,其功能主治为活血化瘀、通调气血、祛风祛湿、消肿止痛,临床用于膝关节骨性关节炎的治疗[9-11]。本文主要从以下两个方面对膝痹消熏洗颗粒进行药效学评价。
3.1 抗炎镇痛作用
膝痹消熏洗颗粒高剂量组对大鼠棉球肉芽肿的增生程度明显降低,对二甲苯所致小鼠耳肿胀的肿胀度明显降低,对冰醋酸所致小鼠扭体反应的扭体潜伏期有明显延长作用,并能明显减少扭体次数;中剂量组亦明显降低对二甲苯所致小鼠耳肿胀的肿胀度[12-13],并且能明显延长对冰醋酸所致小鼠扭体反应的扭体潜伏期和减少扭体次数的作用。提示膝痹消熏洗颗粒有明显的抗炎镇痛作用。
3.2 活血化瘀作用
膝痹消熏洗颗粒高、中、低剂量组对二甲苯所致小鼠皮肤毛细血管通透性增高的皮肤蓝斑色泽深浅评分(级)和吸光度值均有明显降低作用[14];膝痹消熏洗颗粒高剂量组能明显降低大鼠全血黏度、血浆黏度及高切还原黏度,中剂量组亦对大鼠的全血黏度(高切)和血浆黏度有明显降低作用[15]。提示膝痹消熏洗颗粒一定的活血化瘀作用。
上述药效学研究结果表明,膝痹消熏洗颗粒对急性炎症有较强的抗炎镇痛作用,同时还具有一定活血化瘀作用,为膝痹消熏洗颗粒临床应用提供了一定的药理学依据。
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Pharmacodynam ics of Xibixiao Smoked and Washed Granule
GUO Liang,GUO Jianhua,LIU Yusong,etal.Chongqing Osteology and Traumatology Hospital of TCM,Chongqing 400010,China.
Objective:To observe the pharmacodynamic action of Xibixiao smoked and washed granule.M ethods:The rats were treated with Xibixiao smoked and washed granule,and the acute anti-inflammatory,analgesic and acute blood stasismodels of rats were used as the model to observe their pharmacological effects.Results:Xibixiao smoked and washed granule 16.0 mg crude drug/cm had an obvious inhibitory effect on the proliferation degree of cotton pellet granuloma,mouse ear edema induced by dimethylbenzene,writhing reaction induced by acetic acid in mice and increased capillary permeability induced by dimethylbenzene in mouse skin.Besides,it could significantly reduce the blood viscosity,plasma viscosity and high-shear reduction viscosity.Conclusion:Xibixiao smoked and washed granule has a strong anti-inflammatory and analgesic effect on acute inflammation,and also has the effectof promoting blood circulation and removing blood stasis.
Xibixiao smoked and washed granule;Pharmacodynamics
R285.5
A
1004-745X(2017)07-1156-04
10.3969/j.issn.1004-745X.2017.07.008
2017-04-14)
重庆市卫生和计生委课题(ZY20150228)