HPLC法同时测定黄芪药材中10种黄酮类成分的含量Δ

张 妍，董 琳，雍婧姣，毛福英，尹 蕾，付雪艳#（.宁夏医科大学宁夏回药现代化工程技术研究中心，银川 75000；2.宁夏医科大学宁夏回医药现代化省部共建教育部重点实验室，银川 75000）

HPLC法同时测定黄芪药材中10种黄酮类成分的含量Δ

张 妍1，2＊，董 琳1，雍婧姣1，毛福英1，尹 蕾1，付雪艳1#（1.宁夏医科大学宁夏回药现代化工程技术研究中心，银川 750001；2.宁夏医科大学宁夏回医药现代化省部共建教育部重点实验室，银川 750001）

目的：建立同时测定黄芪药材中10种黄酮类成分含量的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Agilent SB-C18，流动相为乙腈-0.3%甲酸溶液（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为254 nm，柱温为35℃，进样量为10 μL。结果：毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷、异槲皮苷、染料木苷、刺芒柄花苷、毛蕊异黄酮、槲皮素、染料木素、山柰酚、异鼠李素和芒炳花素检测进样量线性范围分别为0.030 29～1.514 5 μg（r＝0.999 4）、0.015 00～0.7 500 μg（r＝0.999 5）、0.007 39～0.369 5 μg（r＝0.999 1）、0.120 11～6.005 5 μg（r＝0.999 8）、0.038 36～1.918 μg（r＝0.999 9）、0.029 89～1.494 5 μg（r＝0.999 5）、0.007 04～0.352 μg（r＝0.999 4）、0.016 83～0.841 5 μg（r＝0.999 5）、0.004 54～0.227 μg（r＝0.999 9）、0.013 36～0.668 μg（r＝0.999 9）；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜2.0%；加样回收率分别为99.55%～100.45%（RSD＝0.36%，n＝6）、99.34%～101.00%（RSD＝0.59%，n＝6）、98.05%～100.36%（RSD＝1.27%，n＝6）、99.73%～100.13%（RSD＝0.18%，n＝6）、99.70%～100.30%（RSD＝0.22%，n＝6）、99.67%～103.27%（RSD＝1.37%，n＝6）、98.13%～104.41%（RSD＝2.37%，n＝6）、96.35%～100.06%（RSD＝1.46%，n＝6）、99.47%～101.13%（RSD＝0.60%，n＝6）、99.70%～100.06%（RSD＝0.15%，n＝6）。结论：该方法操作简便，精密度、稳定性、重复性好，可用于黄芪药材中10种黄酮类成分含量的同时测定。

黄芪；黄酮类成分；含量测定；高效液相色谱法

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of 10 flavonoids in Astragalus membranaceus. METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Agilent SB-C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.3%formic acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 254 nm，and the column temperature was 35℃.The sample size was 10 μL.RESULTS：The linear ranges of calycosin-7-O-glucoside，isoquercitrin，genistin，ononin，calycosin，quercetin，genistein，kaempferol，isorhamnetin and formononetion were 0.030 29-1.514 5 μg（r＝0.999 4），0.015 00-0.7 500 μg（r＝0.999 5），0.007 39-0.369 5 μg（r＝0.999 1），0.120 11-6.005 5 μg（r＝0.999 8），0.038 36-1.918 μg（r＝0.999 9），0.029 89-1.494 5 μg（r＝0.999 5），0.007 04-0.352 μg（r＝0.999 4），0.016 83-0.841 5 μg（r＝0.999 5），0.004 54-0.227 μg（r＝0.999 9），0.013 36-0.668 μg（r＝0.999 9），respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 2.0%.The recoveries were 99.55%-100.45%（RSD＝0.36%，n＝6），99.34%-101.00%（RSD＝0.59%，n＝6），98.05%-100.36%（RSD＝1.27%，n＝6），99.73%-100.13%（RSD＝0.18%，n＝6），99.70%-100.30%（RSD＝0.22%，n＝6），99.67%-103.27%（RSD＝1.37%，n＝6），98.13%-104.41%（RSD＝2.37%，n＝6），96.35%-100.06%（RSD＝1.46%，n＝6），99.47%-101.13%（RSD＝0.60%，n＝6），99.70%-100.06%（RSD＝0.15%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：This method is convenient，sensitive，stable and reproducible，can be used for simultaneous determination of 10 flavonoids in A.membranaceus.

KEYWORDSAstragalus membranaceus；Flavonoids；Content determination；HPLC

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜荚黄芪A.membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根。其味甘，性微温，归肺、脾经，具有补气升阳、益卫固表、利尿消肿、生津养血、托毒排脓、敛疮生肌等功效，临床用于气虚乏力、食少便溏、中气下陷、久泻脱肛、便血崩漏、表虚自汗、气虚水肿、血虚痿黄、内热消渴等症[1]。近年研究表明，黄芪主要含黄芪多糖、黄芪皂苷和黄酮类成分，具有增强免疫系统功能、抗心肌缺血、双向调节血压、保护血管内皮细胞、保肝、抗肿瘤、清除自由基和抗衰老等作用[2-4]；黄芪药材中黄酮类成分共分离出几十余种，主要有槲皮素、山柰酚、异鼠李素、羟基异黄酮、异黄烷、芦丁、芒柄花素、毛蕊异黄酮、染料木苷、染料木素、刺芒柄花苷等[5-6]。本试验采集内蒙、山西、河南、甘肃、宁夏等地21批黄芪药材，利用高效液相色谱法（HPLC）测定了黄芪药材中10种黄酮类成分的含量，为黄芪药材的质量控制及合理开发利用资源提供了依据。

1 材料

1.1 仪器

1260型HPLC仪，包括DAD检测器（美国Agilent公司）；AL-204型电子分析天平（瑞士Merrler-Toledo公司）、CPA225D型电子分析天平（德国Sartorius公司）；KQ3200型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司，功率：250 W，频率：40 kHz）。

1.2 试剂

毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷对照品（批号：14110905）、异槲皮苷对照品（批号：15070211）、染料木苷对照品（批号：15021802）、刺芒柄花苷对照品（批号：15052010）、毛蕊异黄酮对照品（批号：14121511）、槲皮素对照品（批号：15090717）、染料木素对照品（批号：14110908）、山柰酚对照品（批号：14110508）、异鼠李素对照品（批号：14102108）、芒柄花素对照品（批号：15061408）均购自成都思天德生物科技有限公司，纯度均＞98%；甲醇、甲酸均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

1.3 药材

21批黄芪药材均采自不同产地（见表1），经宁夏医科大学药学院董琳博士鉴定为豆科蒙古黄芪A. membranaceus（Fisch.）Bge.var.monghlicu（Bge.）Hsiao的干燥根。

表1 黄芪药材来源Tab 1 Source ofA.membranaceus

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.3%甲酸溶液（B），梯度洗脱（0～15 min，5%→20%A；15～30 min，20%→25%A；30～35 min，25%→30%A；35～40 min，30%A；40～60 min，30%→40%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：35℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 取各待测成分对照品各适量，精密称定，加甲醇制成毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷、异槲皮苷、染料木苷、刺芒柄花苷、毛蕊异黄酮、槲皮素、染料木素、山柰酚、异鼠李素和芒炳花素质量浓度分别为30.29、15.00、7.39、120.11、38.36、29.89、7.04、16.83、4.54、13.36 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取样品约5 g，研细（过4号筛），精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加甲醇50 mL，称定质量，放置过夜，50℃下超声处理1 h，放冷，滤过，滤液浓缩至干，用甲醇溶解并定容至5 mL，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 系统适用性试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。结果，毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷、异槲皮苷、染料木苷、刺芒柄花苷、毛蕊异黄酮、槲皮素、染料木素、山柰酚、异鼠李素和芒炳花素保留时间分别为15.6、17.6、18.5、27.7、35.7、36.6、43.4、45.8、47.2、53.4 min，各成分基线分离良好；理论板数均＞1.5。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 线性关系考察

分别精密量取“2.2.1”项下对照品溶液1、5、10、20、50 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分进样量（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，回归方程与线性范围见表2。

表2 回归方程与线性范围Tab 2 Regression equations and liner ranges

2.5 精密度试验

取“2.2.1”项下对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷、异槲皮苷、染料木苷、刺芒柄花苷、毛蕊异黄酮、槲皮素、染料木素、山柰酚、异鼠李素和芒炳花素峰面积的RSD分别为0.59%、1.10%、0.41%、0.54%、0.94%、0.27%、0.68%、0.61%、0.57%、0.64%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（编号：3）适量，分别于室温下放置0、4、8、12、18、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷、异槲皮苷、染料木苷、刺芒柄花苷、毛蕊异黄酮、槲皮素、染料木素、山柰酚、异鼠李素和芒炳花素峰面积的RSD分别为0.06%、0.62%、1.45%、0.15%、0.09%、1.20%、1.31%、1.95%、1.53%、0.77%（n＝6），表明供试品溶液室温放置24 h内基本稳定。

2.7 重复性试验

精密称取同一批样品（编号：3）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量。结果，毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷、异槲皮苷、染料木苷、刺芒柄花苷、毛蕊异黄酮、槲皮素、染料木素、山柰酚、异鼠李素和芒炳花素平均含量分别为2.274 0、0.073 8、0.045 5、1.578 0、1.448 8、0.210 1、0.005 5、0.069 6、0.014 0、0.114 6 mg/g，RSD分别为0.13%、1.75%、1.66%、0.06%、0.07%、0.61%、1.87%、0.96%、0.64%、0.46%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量样品（编号：3）适量，共6份，分别加入一定质量的待测成分对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表3。

表3 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 3 Results of recovery tests（n＝6）

2.9 药材样品含量测定

取21批样品各适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表4。

表4 药材样品含量测定结果（n＝3，mg/g）Tab 4 Results of contents determination of samples（n＝3，mg/g）

3 讨论

3.1 流动相的选择

黄芪中黄酮类成分较多且呈弱酸性，故采用酸性缓冲系统[7]，本研究考察了乙腈-磷酸、乙腈-甲酸系统，发现使用甲酸作为抑制剂，黄酮类成分分离良好；此外还考察了不同梯度的流动相配比，最终发现当流动相A为乙腈，B为0.3%甲酸溶液，梯度洗脱（0～15 min，5%→20%A；15～30 min，20%→25%A；30～35 min，25%→30%A；35～40 min，30%A；40～60 min，30%→40%A）时10种黄酮类成分能全部分离，且与相邻色谱峰的分离度＞1.5，故选其为流动相。

3.2 提取方法的选择

相关文献报道，超声法提取黄芪总黄酮比连续回流提取法具有快速、节省溶剂、提取的有效成分含量高等优点[8]。本试验考察了超声、浸泡、回流等提取方式，发现先浸泡过夜后超声50℃提取60 min，再将提取液浓缩至5 mL时提取的黄酮类有效成分较多，且提取方法简单快捷，故采用先浸泡过夜再超声提取的方法进行提取。

3.3 检测波长的选择

相关文献报道，毛蕊异黄酮苷和毛蕊异黄酮在258 nm波长处有最大吸收，在288 nm波长处有肩峰；芒柄花苷和芒柄花素在248 nm波长处有最大吸收，在290 nm波长处有肩峰[9-10]；染料木素及染料木苷在260 nm波长处有最大吸收[11]；槲皮素在255 nm波长处有最大吸收，山柰酚在266 nm波长处有最大吸收[12]。用二极管阵列检测器全波长（200～400nm）扫描供试品溶液，得出指纹图谱，依据色谱图尽可能的兼顾大部分吸收峰，发现各成分在254 nm波长处均有较好的峰形和峰面积，故选此波长为检测波长。

综上所述，本方法操作简便，精密度、稳定性、重复性好，可用于黄芪药材中10种黄酮类成分含量的同时测定。

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Simultaneous Determination of 10 Flavonoids in Astragalus membranaceus by HPLC

ZHANG Yan1，2，DONG Lin1，YONG Jingjiao1，MAO Fuying1，YIN Lei1，FU Xueyan1（1.Ningxia Research Center for Modern Engineering and Technology of Hui Medicine，Ningxia Medical University，Yinchuan 750001，China；2.Ningxia Key Lab of Hui Medicine Modernization，Ministry of Education，Ningxia Medical University，Yinchuan 750001，China）

R917

A

1001-0408（2017）21-2970-04

2016-08-27

2016-10-11）

（编辑：张 静）

宁夏自然科学基金资助项目（No.NZ14060）

＊助理实验员，硕士。研究方向：药品质量标准提高。E-mail：bloom77@163.com

#通信作者：教授，博士。研究方向：中药提取分离与结构鉴定。E-mail：fuxueyan1215@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.21.25