离子注入不动杆菌的降解特性

马睿 蔡长龙 梁海锋 严一心

摘要 [目的]选育能够高效降解石油烃的不动杆菌。[方法]采用低能N+对不动杆菌菌株a8进行诱变，测量离子注入前后不动杆菌对石油烃的降解率，并研究其降解能力和降解机理。[结果]当N+的注入能量和注入剂量分别为15 keV和8.0×1015 ions/cm2时，不动杆菌的降解率可提高至95.03%；利用该注入参数对出发菌种a8进行3次连续诱变后，获得1株能有效降解59种烷烃的突变菌株AQ-15；结合分子生物学技术，对AQ-15降解长链石油烷烃的酶AlmA基因进行分析，发现酶结合位点之一的47th氨基酸由原来的天冬氨酸（Asp，D）变为甘氨酸（Gly，G），从而提高了酶的活性，达到了高效降解长链石油烷烃的效果，揭示了离子注入后不动杆菌降解率提高的机理。[结论]选育出1株能够高效降解石油烃的不动杆菌菌株AQ-15。

关键词 离子注入；不动杆菌；降解率；降解机理

中图分类号 X172 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）07-0001-03

Degradation Characteristics of Ion Implantation Acinetobacter

MA Rui， CAI Chang-long， LIANG Hai-feng et al

（Xian Technological University， Ion Beam Bioengineering and Biodiversity Research Center， Xian， Shaanxi 710021）

Abstract [Objective] The aim was to screen out Acinetobacter strains which could effectively degrade petroleum hydrocarbons. [Method] We mutated Acinetobacter strain a8 by low energy N+， measured degradation rate of Acinetobacter strain a8 to petroleum hydrocarbons before and after ion implantation， and studied its degradation ability and degradation mechanism. [Result] When the injection energy and injection dosage were 15 keV and 8.0×1015 ions/cm2 respectively， the degradation rate of Acinetobacter reached 95.03%； through three continuous mutation of start strain a8 under above injection parameters， a mutant strain AQ-15 which could effectively degrade 59 kinds of alkanes were obtained. The AlmA gene of AQ-15 to degrade long chain paraffin oil was analyzed by combining molecular biology techniques， and it was found that 47th amino acids changed from aspartic acid （Asp，D）into glycine （Gly，G）， and enzyme activity was improved to get target of effectively degrading long chain paraffin oil， which revealed the improvement mechanism of degradation rate of Acinetobacter after ion implantation. [Conclusion] A Acinetobacter strain AQ-15 which could effectively degrade petroleum hydrocarbons was screened out.

Key words Ion implantation；Acinetobacter；Degradation rate；Degradation mechanism

石油類产品是重要的能源和工业原料，随着其使用范围的不断扩大，石油类产品的排放物对土壤生态系统结构的破坏问题也日益凸显，石油污染治理刻不容缓[1]。科研工作者提出了一系列治理石油污染的技术，包括物理、化学、生物等方式，其中，生物治理依据微生物能以烃类为唯一碳源和能源生长，将烃降解成对环境无害的产物 CO2和H2O的特点，相比物理、化学治污具有安全、效果好、成本低、处理彻底、无二次污染等优点，是一种经济效益和环境效益俱佳并且能解决复杂环境污染问题的有效治污手段[2]。目前已有多个菌种被证实能够降解石油烃，周常义等[3]从受污海水中筛选出能以0#柴油为唯一碳源的不动杆菌，该菌株在最适pH 7.0、温度28 ℃条件下，经过3 d培养，其降解率仅为38.7%～56.2%。张子间等[4]从石油污染的土壤中分离筛选出1株能够降解石油烃的绿叶假单胞菌，并采用10 mV的He-Ne激光進行辐照，诱变选育出1株高效降解石油烃的不动杆菌，其在最适生长条件下，比未受辐照的菌株降解相同石油烃缩短24 h。因此，采用新技术诱变选育高效石油烃降解菌株是推广微生物治理生态环境的当务之急。

离子注入诱变育种是将一定能量的离子束射入生物体内，通过入射离子的能量、质量、动量和电荷4种因素作用，引起生物体细胞内一系列生化反应使基因产生突变，再从这些变异的种子中筛选出正性变异种类，经过培育而成为新品种的一项技术。该技术具有变异频率高、变异谱宽、变异快、变异稳定可靠等优点[5]。笔者从长庆油田的含油污泥中筛选、鉴定出1株不动杆菌，采用离子注入技术对其诱变，测定了离子注入前后不动杆菌对石油烃的降解率，通过连续注入低能N+培育出1株不动杆菌菌株，利用GC-MS法对其降解特性和降解能力进行了研究，并通过不动杆菌基因组测序，揭示了其降解率提高的机理，最终获得了1株高效降解石油烃的不动杆菌菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株。

从陕西省长庆油田附近提取的含油污泥中筛选出1株能以原油为唯一碳源生长的菌株a8，通过分子生物学鉴定确认为不动杆菌属（Acinetobacter sp.）。

1.1.2 培养基。

无机盐溶液：K2HPO4 5.00 g/L，（NH4）2SO4 1.00 g/L，MgSO4 0.25 g/L，NaNO3 2.00 g/L，NaCl 5.00 g/L，K2HPO4·3H2O 1.00 g/L，pH 7.0～7.2。LB培养基：胰蛋白胨 10.00 g/L，NaCl 10.00 g/L，酵母粉 5.00 g/L，pH 7.0～7.2。基础培养基：K2HPO4 0.50 g/L，CaCl2 0.02 g/L，MgSO4·7H2O 0.20 g/L，NH4NO3 1.00 g/L，FeCl3 0.05 g/L，K2HPO4·3H2O 1.50 g/L，琼脂粉13.00 g/L，pH 7.0～7.2。原油培养基：无机盐溶液中添加原油2%，pH 7.0～7.5；原油来自于长庆油田（C15～C28，黏度为128 mPa·s）。

1.1.3 仪器。采用四川成都同创材料表面新技术工程中心研制的生物改性离子注入设备，该设备的气体离子源加速电压为10～70 kV连续可调，最大束流为8 mA，束斑直径≥100 mm。试验中高纯氮气流量为6 sccm，工作气压为1.3×10-3 Pa，加速电压為15～20 kV，注入剂量为2.0×1015～12.0×1015 ions/cm2可调，灯丝电流为10 A，引出电压为60 V，抑制电压为1 kV。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化与分离。

将分离保藏的出发菌株a8置于LB固体培养基上30 ℃活化24 h后，观察其生长形态。挑取活化后的菌落接种到液体基础培养基中，并于30 ℃、110 r/min条件下培养16 h得1#菌液。

1.2.2 离子注入不动杆菌。

取适量1#菌液，加入無菌水稀释至浓度为1.0×107 CFU/mL，取0.1 mL菌液均匀涂布于无菌平皿中央，无菌风吹干制成菌膜，以N+为低能离子注入源，注入能量为15 keV，注入离子剂量分别为0和8.0×1015 ions/cm2。离子注入采用间隔式注入方式，每注入4 s后停止5 s，重复上述注入模式，直到达到所要求的注入剂量。注入后，注入剂量为0的记为M0-a8平皿，注入剂量为8.0×1015 ions/cm2的记为M0-A8平皿。取1.0 mL无菌水至注入平皿中心，用无菌刮铲反复洗脱；取0.1 mL洗脱液涂布于已经准备好的原油培养基平板上，用无菌铲涂抹均匀；将M0-a8平皿和M0-A8平皿上培养的不动杆菌培养24 h后，分别挑选菌体生长快、透明圈大的2个单菌落点接于含烃平皿上，记为M1代，编号分别为M1-a81、M1-a82（注入剂量为0），M1-A81、M1-A82（注入剂量为8.0×1015 ions/cm2）。

1.2.3 GC法石油烃降解率测定。

分别将存活的M1-a81、M1-a82、M1-A81、M1-A82不动杆菌按5%的接种量转接到含有2%原油的液体培养基的三角瓶中（以石油烃为唯一碳源），置于往复式振荡器上，30 ℃、200 r/min培养5 d。培养结束后，8 000 r/min离心10 min，收集上清液，将不同菌株的上清液倒入相应编号的分液漏斗中，加入50.0 mL二氯甲烷，振荡萃取，重复该萃取过程3次，收集二氯甲烷层，40 ℃蒸发至近干，置于比色管中定容至5.0 mL。以不接种的含相同石油烃浓度的基础液体培养基为对照（CK）。用GC9160气相色谱仪分析并计算石油烃降解率。

GC9160气相色谱分析条件：检测器FID，载气N2，色谱柱DB-5，进样口温度300 ℃，检测器温度300 ℃。升温程序：40 ℃，保持5 min；100 ℃，升温速度10 ℃/min，保持5 min；200 ℃，升温速度10 ℃/min，保持5 min；300 ℃，升温速度10 ℃/min，保持5 min。

1.2.4 高效降解不动杆菌菌株培育。

以菌株a8为出发菌株，以离子注入剂量8.0×1015ions/cm2和注入能量15 keV为注入参数，对该菌株进行3轮低能N+注入诱变、培育，获得1株高效降解长链石油烃的菌株，命名为AQ-15。

1.2.5 GC-MS法石油烃降解谱测定。

以出发菌株a8为对照，利用GC-MS法分析菌株a8与菌株AQ-15降解谱的变化。将AQ-15接入液体培养液中培养96 h，用正己烷萃取发酵液，进行GC-MS残油组分检测分析。

取重量法中定容后溶液1.0 mL稀释100倍作为检测样品。气相色谱仪条件：毛细管色谱柱RTX-5SM，内径0.25 mm，膜厚0.25 μm，长度20 m，柱温采用多阶段程序升温，初温60 ℃，保持5 min，4 ℃/min升至130 ℃，保持2 min，再以12 ℃/min升至180 ℃，保持2 min，最后以7 ℃/min升至280 ℃，保持10 min，进样温度260 ℃，载气为高纯氦，恒流流量1 mL/min，分流比5∶1，进样量1 μL。质谱仪条件：电离方式为电子轰击（EI+），电离能量70 eV，离子源温度200 ℃，检测温度250 ℃。

1.2.6 不动杆菌降解机理研究。

利用生物信息学分析不动杆菌降解机理，设计引物（正向引物：5′-atgcctgtcgaacacctgga-3′；反向引物：5′-tcaacccagcgcgtgcaccg-3′），分别以A-8和AQ-15菌株基因组DNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系（50.0 μL）：模板（约60 ng/μL）2.0 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）4.0 μL，缓冲液 5.0 μL，正反向引物（20 μmol/L）各2.0 μL，3 U Taq DNA聚合酶 1.0 μL，ddH2O 35.7 μL。PCR反应条件：94 ℃ 1 min；52 ℃ 2 min；72 ℃ 1 min，30个循环。对PCR扩增产物进行琼脂糖DNA回收后测序，测序结果用DNAMAN软件进行分析并翻译成相应的蛋白质序列。蛋白质三维结果模拟由I-TASSER在线服务系统进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 不动杆菌的鉴定

对出发菌a8在30 ℃下培养24 h后，菌落呈乳白色圆形，不透明，边缘不光滑，表面扁平。生理生化试验结果表明，a8为革兰氏阴性细菌，氧化酶接触呈阳性，淀粉水解呈阳性，好氧，对照《伯杰细菌鉴定手册》，该菌株特征与不动杆菌属一致。

2.2 离子注入前后不动杆菌的降解率

由表1可知，菌落M1-A82的降解率最高，达95.03%，结合对二氯甲烷萃取液分液前的观察， M1-A82菌株的有机相颜色最浅，说明该菌的发酵液中残留的石油烃相对较少，该菌对石油烃的降解能力最强。

2.3 高效降解不动杆菌的降解特性

采用GC-MS对出发菌株a8和诱变菌株AQ-15处理的石油残油组分进行分析。由图1、2可知，出發菌株的原油中含有C8～C36的多种烷烃，而诱变菌株降解后的残油组分中只能检测少量的长链烷烃，降解效果明显，表明诱变菌株具有高效降解长链烷烃的能力。

根据GC-MS分析结果，出发菌株a8可以完全降解29种化合物，而诱变后得到的菌株AQ-15可以降解59种化合物，比出发菌株能多降解30种化合物，降解能力大幅度提高。

2.4 离子注入不动杆菌的降解机理

根据现有研究报道，在石油降解菌的烷烃降解酶系统中，降解长链烷烃主要为长链烷烃羟化酶AlmA[6]。为阐明突变菌株高效降解长链石油烷烃的分子机理，依据不动杆菌基因组测序结果，经分析后AlmA长链石油烷烃酶基因全长为1 500 bp，编码500个氨基酸，其基因序列经Blast比对后，同源性与NCBI中报道基因相似度为98%，诱变前后AlmA降解酶DNA序列及蛋白质序列比较如图3所示，其中Sbjct为出发菌株，Query为诱变菌株，根据比对结果可知，突变位点发生在成熟肽区域，经诱变后140th核苷酸由原来的A变为H，相应的47th氨基酸由原来的天冬氨酸（Asp，D）变为甘氨酸（Gly，G）。其酶的一个结合位点为Asp47。由此可知，天冬氨酸为极性带负电荷酸性氨基酸，而甘氨酸为非极性氨基酸，且突變位点发生在酶结合位点Asp47，说明突变可能改变了结合位点结构，使得酶活性有所提高。

3 结论

将低能N+注入不动杆菌菌株a8，测定了N+注入前后不动杆菌的降解率，当N+的注入能量和注入剂量分别为15 keV和8.0×1015ions/cm2时，不动杆菌的降解率有所提高，可达95.03%；利用上述离子注入参数对出发菌种a8经过3次连续诱变，筛选培育后获得了1株降解长链石油烷烃能力较高的突变菌株AQ-15，该菌株能有效降解59种烃烷；以AQ-15为研究对象，结合分子生物学技术，对其降解长链石油烷烃的酶AlmA基因进行分析，结果表明酶结合位点之一的47th氨基酸由原来的天冬氨酸（Asp，D）变为甘氨酸（Gly，G），从而提高了酶的活性，达到了高效降解长链石油烷烃的效果，揭示了离子注入后不动杆菌降解率提高的机理。

参考文献

[1] 陈丽华.黄土塬石油污染土壤的降解规律及生物修复优化研究[D]. 兰州：兰州大学，2012：1-3.

[2] 孙国华，任利华，刘爱英，等.一株石油烃降解菌分子鉴定及特性分析[J].生物技术通报，2010（9）：210-214.

[3] 周常义，林情员，苏国成，等.一株海洋石油烃降解菌的分离鉴定及特性研究[J].集美大学学报（自然科学版），2009，14（1）：20-24.

[4] 张子间，刘勇弟，卢杰，等.He-Ne激光诱变选育高效石油烃降解菌的研究[J].环境工程学报，2012，6（2）：677-682.

[5] 余增亮.离子束生物技术引论[M].合肥：安徽科学技术出版社，1996.

[6] 吴福顺.渤海溢油区石油降解菌的筛选鉴定及功能基因研究[D].青岛：中国海洋大学，2013：20-22.