一株耐砷菌的鉴定及处理含砷废水研究

唐 萌，张艮林，黄雄英，万 静，张紫涵

(1.云南大学建筑与规划学院，云南 昆明650091；2.云南大学材料科学与工程学院，云南 昆明650091；3.国际河流与生态安全研究院，云南 昆明650091；4.云南大学生态学与环境学院，云南 昆明650091)



一株耐砷菌的鉴定及处理含砷废水研究

唐 萌1，张艮林2，黄雄英3，万 静4，张紫涵4

(1.云南大学建筑与规划学院，云南 昆明650091；2.云南大学材料科学与工程学院，云南 昆明650091；3.国际河流与生态安全研究院，云南 昆明650091；4.云南大学生态学与环境学院，云南 昆明650091)

对从云南省个旧市大屯海筛选出的一株耐砷菌进行鉴定和除砷性能研究。经生理生化实验和16S rDNA测序鉴定其为库克菌(Kocuria carniphila)。实验表明，此菌对模拟废水中的As(Ⅲ)具有较好的去除效果。当pH值为8，发酵液投加量为5mL，CaCl2质量分数为5%，摇床转速为180 r/min时除砷率达到最大值55%。

耐砷菌；16S rDNA测序；含砷废水处理

砷(As)称为类金属，在世界范围内广泛存在，虽然含量很少，但却是地壳中毒性最大的元素之一，其丰度为2 g/t。含砷废水主要来源于有色金属冶炼、硫化物的开采利用、农药、染料、制酸、合金、玻璃及防腐剂等工业的排水，因此每年因工业生产会使大量的砷进入到环境中。

美国权威科学杂志公布的调查结果显示，我国的新疆、内蒙古、甘肃、云南、河南和山东等地都是砷污染高危地区，砷含量高于10 μg/L的地区总面积约为58万km2，近2000多万人生活在砷污染高危地区[1-3]。由于水体砷污染对人体的危害，1993年世界卫生组织将饮用水中的砷标准由原来的50 μg/L降低为10 μg/L。在2007年,我国也将饮用水中的砷标准调整为10 μg/L，2006年美国环保局将砷列为第一位饮用水污染物[4-7]。水体砷污染已经造成了严重的环境问题，受到了社会各界的广泛关注。本文通过对除砷微生物的研究，希望能发现并找到对砷有较高去除率的微生物，从而为微生物法除砷机理探究提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

菌种前期筛选自云南省个旧市大屯海，现为实验室4℃保存。

种子培养基：酵母浸膏5.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，氯化钠10.0 g/L，初始pH为7.0，121℃灭菌15 min。

发酵培养基：蔗糖40.0 g/L、磷酸氢二钾(分析纯)5.0 g/L、磷酸二氢钾(分析纯)2.0 g/L、氯化钠(分析纯)0.1 g/L、酵母浸膏4.0 g/L、硫酸镁(分析纯)0.2 g/L，pH=7.0，115℃下灭菌15 min。

1.2 菌种鉴定

1.2.1 细菌形态观察

细菌个体观察：采用传统革兰氏染色法，取经活化20 h的菌液，通过涂片、干燥和固定后，再进行初染、媒染、脱色、复染等步骤，最后进行观察。若菌体呈红色，则为革兰氏阴性菌；若菌体呈蓝紫色，则为革兰氏阳性菌。

细菌菌落观察：取经活化20 h的菌液，稀释后用涂布器涂布到LB固体培养基上，在30℃的恒温培养箱中培养24 h后观察菌落形态特征。

1.2.2 生理生化实验[8,9]

根据《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》，本实验主要进行了明胶液化实验、淀粉水解实验、伏-普实验(VP实验)、葡萄糖氧化发酵实验 、柠檬酸盐利用实验和吲哚实验。

1.2.3 16S rDNA序列鉴定[10-13]

DNA的提取采用土壤中总DNA的提取方法，设计PCR引物为：Eu 7F，5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’；Eu 1540R，5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。PCR程序设定为：94℃预变性4 min；94℃ 45sec、55℃ 45 sec、72℃ 1 min，循环30次；72℃修复延伸10min；4℃保温。PCR产物送上海生工生物工程技术服务公司进行测序，所得16S rDNA序列提交到Genbank核酸序列数据库中，将16S rDNA序列与已知序列进行比对，下载与该菌株同源性较高的序列，通过Clustal软件进行分析，然后用MEGA软件构建该菌株的系统发育树。

1.3 除砷条件优化研究

实验以模拟废水为研究对象，分别进行了不同的pH、发酵液投加量、CaCl2质量分数和转速等条件下的单因素实验，处理后的反应液采用原子荧光法进行测定。

2 结果与分析

2.1 菌株的鉴定

2.1.1 菌株的形态学研究

此菌株的形态学特征鉴定结果表明：菌落形态成圆形、边缘整齐、淡粉色、蜡状、菌落小，表面湿润光滑，细胞形态成较大球形(如图1所示)。

2.1.2 菌株的生理生化特征研究

此菌株的生理生化特征研究结果如表1所示。

表1 菌株的生理生化特征研究结果

2.1.3 16S rDNA鉴定

将PCR产物送到上海生工生物工程技术服务公司进行测序，并将所得16S rDNA序列与Genbank核酸序列数据库中的已知序列进行对比，然后经Clustal软件进行同源性分析，并用MEGA软件构建出该菌株的系统发育树(如图2所示)。

从菌株的系统发育树可以看出，此菌株与库克菌(Kocuria carniphila)在同一个分支上，并且此菌株的基因序列与库克菌(Kocuria carniphila)的基因序列的同源性达到了98.3%。

因此，通过对此菌株的生理生化特征研究和16S rDNA测序鉴定，我们可以认为此菌株为库克菌(Kocuria carniphila)。

2.2 除砷条件优化研究

2.2.1 pH值对除砷率的影响

配制50 mL浓度为100 mg/L的含As废水5份，分别置于5个250 mL的三角瓶中，加入4 mL发酵液和5 mL 10%的CaCl2溶液，用0.1 mol/L的H2SO4或NaOH溶液调节pH值分别为2、4、6、8、10。置于30℃的恒温震荡箱中，以150 r/min的转速处理2 h，静置20 min取其上清液测定残留As浓度，实验数据如图3所示。

由图3可以看出，当pH在2～8时，除砷率随pH的增大而逐渐增高；pH值在8～10时，除砷率随pH的增大而减小；当pH值为8时，除砷率达到了最大值33.73%。由此可以看出，此菌株在偏碱性的环境中除砷率效果更好。

2.2.2 发酵液投加量对除砷率的影响

配制50 mL浓度为100 mg/L的含As废水5份，分别置于5个250 mL的三角瓶中，用0.1 mol/L的H2SO4或NaOH溶液调节pH值为8，再加入5 mL 10%的CaCl2溶液，分别调节发酵液投加量为0、1、2、3、4、5、6 mL。置于30℃的恒温震荡箱中，以150 r/min的转速处理2 h，并静置20 min取其上清液测定残留As浓度，实验数据如图4所示。

由图4可以看出，当发酵液的投加量为0～1时，除砷率出现了剧增，除砷率从投加量为0时的6%增大到了发酵液为1时的36.62%；当发酵液投加量继续增大时，除砷率也在逐渐增大。当发酵液投加量为5 mL时，除砷率达到了最大值47.66%，此后随着发酵液投加量的增大，除砷率反而减小。因此对于此菌株而言，发酵液投加量为5 mL时为最佳投加量。

2.2.3 CaCl2浓度对除砷率的影响

配制50 mL浓度为100 mg/L的含As废水5份，分别置于5个250 mL的三角瓶中，用0.1 mol/L的H2SO4或NaOH溶液调节pH值为8，发酵液投加量为5 mL，再加入5 mL质量分数(%)为0、5、10、15、20、25的CaCl2溶液。置于30℃的恒温震荡箱中，以150 r/min的转速处理2 h，并静置20 min取其上清液测定残留As浓度，实验数据如图5所示。

由图5可知，不同质量分数的CaCl2溶液对除砷率也有一定的影响。当不投加CaCl2溶液时，除砷率只有41%；当CaCl2溶液的质量分数为5%时，除砷率达到了最大值55%。之后随着CaCl2溶液的质量分数的增大，除砷率缓慢减小。由此可知，CaCl2溶液对菌株的除砷有一定的促进作用。对此菌株而言，CaCl2溶液的最佳质量分数为5%。

2.2.4 摇床转速对除砷率的影响

配制50 mL浓度为100 mg/L的含As废水5份，分别置于5个250 mL的三角瓶中，用0.1 mol/L的H2SO4或NaOH溶液调节pH值为8，发酵液投加量为5 mL，再加入5 mL质量分数为5%的CaCl2溶液，调节摇床转速为100、140、180、220、260、300 r/min。置于30℃的恒温震荡箱中，处理2 h，并静置20 min取其上清液测定残余As浓度，实验数据如图6所示。

由图6可知，当摇床转速为100～180 r/min时，随着转速的增加除砷率也在逐渐增大，在摇床转速为180 r/min时，除砷率达到了最大值55%。之后随着转速的持续增大，除砷率反而减小。因此可以看出，对于此菌株除砷的最佳转速为180 r/min。

3 结论与趋势

本实验从云南省个旧市大屯海筛选出来的菌株，对模拟废水中的As(Ⅲ)具有较好的去除效果。经生理生化特征研究和16S rDNA鉴定，此菌株为库克菌(Kocuria carniphila)。菌株的除砷率已达到了55%，后期的研究中我们将对菌株的除砷机理进行研究，从而进一步揭示此菌株对水体As(Ⅲ)的去除机制。

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The Identification of an Arsenic-Resistant Bacteria and its Ability of Treating Arsenic-containing Wastewater

TANG Meng1,ZHANG Gen-lin2,HUANG Xiong-ying3,WAN Jing4,ZHANG Zi-han4

(1.School of Architecture and Planning,Yunnan University, KunmingYunnan 650091,China)

The study on identification and arsenic removal performance of an arsenic-resistant bacteria’s from DatunLakeinGeJiu in Yunnan Province was conducted.It was identified to be Kocuriacarniphilathrough physiological and biochemical experiment and 16SrDNA sequence analysis.Experimental results showed that the bacteriahad a better removal effectforAs(Ⅲ)from simulated wastewater.The bacteria’s arsenic removal rate could reach 55%when the pH was 8,the amount of fermentation liquid was 5ml,the mass fraction of CaCl2was 5%, and the shaker’s rotating speed was 180r/min.

arsenic-resistant bacteria; 16SrDNA sequence analysis; treatment of arsenic-containing wastewater.

2017-05-18

国家自然科学基金(51468065)；云南省应用基础研究计划项目(2014FB111)；云南省教育厅科学研究基金资助性项目研究生项目(2016yjs004)；大学生创新创业训练计划项目(201510673006；201610673005)。

唐萌(1993-)，男，陕西省宝鸡市人，硕士研究生，研究方向：重金属污染防治。

张艮林(1978-)，男，副研究员，博士，研究方向：水体重金属污染治理技术与应用。

X703

A

1673-9655(2017)05-0024-04