荔波瑶山鸡POU1F1基因多态性与繁殖性状的相关性

朱丽莉，陶宇航，韩 雪，唐继高，吴松成，李 亮，伍革民

(贵州省畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005)



荔波瑶山鸡POU1F1基因多态性与繁殖性状的相关性

朱丽莉，陶宇航，韩 雪，唐继高，吴松成，李 亮，伍革民*

(贵州省畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005)

【目的】为探明荔波瑶山鸡POU1F1基因多态性与繁殖性状的关系，为荔波瑶山鸡的选择性育种提供参考。【方法】针对POU1F1基因设计6对引物，采用PCR测序法筛选出多态位点，并利用荔波瑶山鸡母系60个个体进行繁殖性状的关联分析。【结果】荔波瑶山鸡POU1F1基因有8个多态位点，其中POU1F1基因58(A→G)与300日龄产蛋量、首次就巢日龄、300日龄就巢次数均呈显著或极显著相关 (P<0.05或P<0.01)；65(T→C)与300日龄产蛋量、首次就巢日龄、300日龄就巢次数呈显著相关 (P<0.05)；11041(T→C)与300日龄产蛋量、首次就巢持续时间、首次就巢至重新开产间隔均呈显著或极显著相关 (P<0.05或P<0.01)。【结论】POU1F1基因58(A→G)和65(T→C)可作为300日龄产蛋量、首次就巢日龄和300日龄就巢次数的辅助选择标记；11041(T→C)可作为300日龄产蛋量、首次就巢持续时间、首次就巢至重新开产间隔的辅助选择标记。

POU1F1基因；基因多态位点；荔波瑶山鸡；繁殖性状

【研究意义】禽类在自然状态下产蛋到一定阶段就会产生就巢行为，大多数家禽尤其是地方品种仍然保持着或强或弱的就巢性。禽类就巢性的遗传机理比较复杂，目前学术界普遍认为，就巢性是由外界环境、内分泌系统、基因表达相互作用的结果。下丘脑-垂体-卵巢轴这一神经内分泌系统的主要生理功能是控制雌性动物的性功能，涉及多种激素，这些激素由多基因表达调控。垂体特异性转录因子(Pituitary Specific Transcriptiona Factorl，POU1F1)是动物垂体前叶特异表达的一种具有重要功能的转录因子，其表达的产物通过与垂体(Prolactin，PRL)、生长激素(Growth Hormone，GH)和促甲状腺素亚β单位(Thyroid Stimulating Hormoneβ，TSHβ)基因以及POU1F1自身的调控元件结合，调控这些基因的转录，从而对动物的生长、发育、繁殖和免疫等很多方面起重要的调控作用[1-3]。因此，关于该基因的遗传变异分析及其与生物性状关系的研究显得极其重要。【前人研究进展】荔波瑶山鸡是贵州优良地方鸡品种资源之一，具有耐粗饲、抗逆性强、适应性强、肉质鲜美细嫩等特点，可作为优质鸡育种的重要素材，但其产业发展受限于其重要经济性能偏低，尤其是开产日龄、产蛋量、就巢性等繁殖性能偏低。【本研究切入点】繁殖性状是多基因控制的复杂性状，受多基因效应影响，其遗传力低，仅通过常规选育方法难以完全剔除就巢性而提高繁殖力的问题。【拟解决的关键问题】采用PCR测序法，分析荔波瑶山鸡POU1F1基因多态性与鸡繁殖性状的关联性，探讨POU1F1基因的多态位点作为繁殖性状遗传标记的可行性，以期为荔波瑶山鸡的选择性育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 荔波瑶山鸡

试验荔波瑶山鸡选自贵州省贵阳市乌当区百宜乡洛坝村种鸡场，60只母鸡。群体一致性较好，性能较为稳定。所有个体均采用常规饲养管理，个体笼养。翅下静脉采血1.0～1.5 mL，加EDTA-Na2抗凝，-20 ℃保存。

1.2 性状测定

120 日龄母鸡转入产蛋舍单个笼养至300 日龄，逐个测定开产日龄、开产体重、就巢性等繁殖性状，测定方法按照NY/T 823-2004[4]进行。

1.3 基因组DNA提取及引物设计

采用TIANamp Blood DNA Kit试剂盒提取血样中的DNA。根据GenBank中鸡的POU1F1基因序列(登录号：NM_204319)，合成6对引物(表1，由天根生化科技有限公司合成)检测POU1F1基因在荔波瑶山鸡60个个体中的基因型遗传变异情况。

1.4 PCR扩增及测序

PCR反应体系20 μl：DNA模板1 μl，上下游引物各1 μl，2×TaqPCR MasterMix 试剂10 μl，加ddH2O至20 μl。PCR反应参数：95 ℃预变性6 min；95 ℃变性30 s，按引物的退火温度退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳检测，委托诺赛基因组研究中心有限公司纯化回收后进行双向测序。

1.5 统计分析

用DNAstar软件对测序结果进行校正，进入基因库网站采用BLAST分析序列SNPs，采用DNAMAN软件分析SNPs变异导致蛋白质编码变异情况。用Excel软件进行数据统计。用Spss 18.0软件，采用单因子方差分析方法分析基因型与繁殖性状的相关性。

2 结果与分析

2.1 多态位点及遗传多态性

6对引物在荔波瑶山鸡POU1F1基因中共检测出8个多态位点(表2)，其中引物1检测出5个多态位点，位于外显子1和内含子1上；引物3检测出1个多态位点，位于内含子3上；引物5和引物6各检出1个多态位点，均位于外显子6上；引物2和引物4未检出多态位点。

根据检测样本数及基因型，计算POU1F1基因8个多态位点的基因频率和基因型频率(表2)。8个多态位点的多肽信息含量在0.12～0.36。

表1 用于荔波瑶山鸡POU1F1基因型检测的引物信息

表2 荔波瑶山鸡POU1F1基因的8个多态位点及其遗传多态性

2.2 8个多态位点与繁殖性状的关联性

POU1F1基因的8个突变位点分别位于外显子1的58(A→G)和65(T→C)，内含子1的332(G→A)、335(A→G)和372(A→G)，内含子3的3171(A→T)，外显子6的11041(T→C)和12188(T→C)。经关联分析，外显子1的58(A→G)和65(T→C)2个位点，外显子6的11041(T→C)位点分别与不同繁殖性状存在显著或极显著关联(P<0.05或P<0.01)；其余5个突变位点与繁殖性状关联不显著(表3)。

2.3 3个关联位点与繁殖性状的相关性

POU1F1基因58(A→G)位点变异不改变蛋白质编码。该位点检测出AA和GG 2种基因型，未发现AG杂合型。设计引物参照的NCBI序列以AA基因型为主，而检测的荔波瑶山鸡样本以GG基因型为主。经比较，GG型比AA型的300日龄产蛋量多31.89枚，首次就巢日龄推迟53.57 d，差异均显著；300日龄就巢次数少2.07次，差异极显著(表4)。

POU1F1基因65(T→C)位点变异不改变蛋白质编码。该位点检测出TC、TT和CC 3基因型。设计引物参照的NCBI序列以TT基因型为主，而检测的荔波瑶山鸡样本以CC基因型为主。该位点CC型、TC型分别比TT型的300日龄产蛋量多30.84和22.00枚，差异均显著；300日龄就巢次数分别少2.04和2.33次，差异均显著；CC型的首次就巢日龄分别比TC型、TT型晚47.31和58.31 d，差异均显著。

表3 荔波瑶山鸡POU1F1基因8个多态位点与不同繁殖性状的关联性

注：NS表示差异不显著(P>0.05)。

Note:NS means not significant difference between treatments(P>0.05).

表4 荔波瑶山鸡POU1F1基因3个多态位点与不同繁殖性状的相关性

注：同行数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

Note: Different lowercase and capital letters in the same row means significant difference at 5 % and 1 % significant levels respectively.

POU1F1基因11041(T→C)位点变异导致蛋白质第279位的异亮氨酸发生同义突变[I(AUU→AUC)]。该位点TT型、TC型分别比CC型的300日龄产蛋量多40.14和36.55枚，差异均显著；TT型比CC型的首次就巢持续时间少20.75 d，TC型比CC型少13.04 d，差异均显著；TT型比CC型的首次就巢至重新开产间隔少7.25 d，差异均显著。

3 讨 论

鸡POU1F1基因定位于1号染色体上，DNA序列全长13 416 bp，有6个外显子。目前，POU1F1基因与家禽生长性能的相关性已有大量研究。XU H Y等[5]研究发现，POU1F1基因T96217999C与山鸡的屠宰性状极显著相关(P<0.01)，C96219442T 则显著相关(P<0.05)。JIANG R等[6]对POU1F1基因单核苷酸的多态性研究发现，AA 基因型与鸡个体体重呈正相关。胡玉萍等[7]研究发现，POU1F1 基因第3外显子的 5231 bp 位置有A—T 碱基的点突变，显著(P<0.05)影响京海黄鸡的周龄体重。廉婷等[8]对二郎山山地鸡研究表明，大体重组的300 日龄总产蛋数极显著(P<0.01)高于中、小体重组。此外，POU1F1基因与鸡个体体重为主的生长性状显著相关(P<0.05)[9-12]。POU1F1 基因是影响鸡生长性状(体重)的主效基因或与主效基因紧密连锁的标记基因，而体重是影响家禽开产日龄、产蛋量等繁殖性状的重要因素之一，POU1F1 基因可作为禽类繁殖性能的标记基因之一。有研究发现，POU1F1基因第6外显子遗传变异与鸡的繁殖性能存在显著相关[9]；外显子3上的突变(A5331T)，CC型个体的72周龄产蛋数显著高于DD型和CD型(P<0.05)[13]；第3外显子的G3109A对狼山鸡16周龄体重和300日龄产蛋量有显著影响(P<0.05)[14]；POUlFl基因的外显子3、4和6上的6个SNP均与藏鸡产蛋量显著相关(P<0.05)[15]；鸭中POU1F1基因第2内含子AA基因型个体的蛋形指数和4周龄体重均显著高于aa型(P<0.05)[16]。荔波瑶山鸡POU1F1基因上有8个SNP，其中第6外显子上11041(T→C)变异与300日龄产蛋量显著相关，与姜润深等[9,15]的研究结果一致；同时第1外显子的58(A→G)和65(T→C)变异与300日龄产蛋量、首次就巢日龄和300日龄就巢次数显著相关。

4 结 论

荔波瑶山鸡POU1F1基因有8个突变位点，分别位于外显子1的58(A→G)和65(T→C)，内含子1的332(G→A)、335(A→G)和372(A→G)，内含子3的3171(A→T)，外显子6的11041(T→C)和12188(T→C)。其中，POU1F1基因58(A→G)与300日龄产蛋量、首次就巢日龄均显著相关(P<0.05)，与300日龄就巢次数极显著相关 (P<0.01)；65(T→C)与300日龄产蛋量、首次就巢日龄、300日龄就巢次数均显著相关 (P<0.05)；11041(T→C)与300日龄产蛋量、首次就巢至重新开产间隔呈显著相关(P<0.05)，与首次就巢持续时间极显著相关(P<0.01)。POU1F1基因58(A→G)和65(T→C)可作为300日龄产蛋量、首次就巢日龄和300日龄就巢次数的辅助选择标记；11041(T→C)可作为300日龄产蛋量、首次就巢持续时间、首次就巢至重新开产间隔的辅助选择标记。

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(责任编辑 冯 卫)

Association of Polymorphic Sites of GenePOU1F1 with Chicken Egg Laying Traits

ZHU Li-li，TAO Yu-hang，HAN Xue，TANG Ji-gao，WU Song-cheng，LI Liang，WU Ge-min*

(Guizhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science，Guizhou Guiyang 550005，China)

【Objective】 The stydy aims to analyze the associations of genePOU1F1 with chicken egg laying traits and provide references for selection breeding of Libo Yaoshan chicken. 【Method】 Six primers were designed and eight polymorphic sites were selected, and the association analysis was performed in 60 chickens of Libo Yaoshan female line by PCR-sequencing methods. 【Result】58(A→G) mutation sites were significantly associated with the total egg number from 120 to 300 d of age (EN300), age at first broodiness behavior (AFBB) and times of broodiness behavior from 120 to 300 d of age (TBB300) (P<0.05 orP<0.01). 65(T→C) mutation sites were significantly associated with EN300, AFBB and TBB300 (P<0.05). 11041(T→C) mutation sites were significantly associated with EN300. Duration of age at first broodiness behavior (DAFBB) and interval of age at first broodiness behavior between anew laying (IAFBBA) (P<0.05 orP<0.01). 【Conclusion】58(A→G) and 65(T→C) may be regarded as an effective molecular marker on the MAS(Marker Assisted Selection)program for EN300, AFBB and TBB300; 11041(T→C) may be regarded as an effective molecular marker for EN300, DAFBB and IAFBBA.

GenePOU1F1; Polymorphic site; Libo Yaoshan chicken; Egg laying trait

1001-4829(2017)7-1675-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.7.037

2016-11-30

贵州省联合基金项目“瑶山鸡ONECUT1基因的CDS区克隆、差异表达及与生产性状关联分析”[黔科合LH字(2015)7067]；贵州省基金项目“瑶山鸡就巢性选育关键基因筛选”[黔科合J字(2014)2102]；贵州省农业动植物育种项目“瑶山鸡新品系选育与推广”[黔农育专字(2014)008]；贵州省农业科学院2014年博士基金项目“瑶山鸡STAT5基因变异检测及与产蛋性状关联分析”；贵州省农业科学院院专项“长顺绿壳蛋鸡绿壳表型遗传标记的筛选与应用”[黔农科院院专项(2014)006]，“百宜黑鸡高产纯繁核心种群选育与示范推广”[黔农科院院专项(2014)038]；市院地合作项目“喀斯特地形山地肉鸡养殖技术推广”[院地农科合字(2014)10]

朱丽莉(1984-)，女，四川成都人，副研究员，硕士，从事家禽遗传育种研究，E-mail: zhuerms@163.com，*为通讯作者：伍革民，E-mail:wgmabcdef@163.com。

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