右美托咪定对脓毒症小鼠炎症反应的影响及机制研究

郭 茂，王文明(泸州市人民医院麻醉科，四川泸州 646000)

右美托咪定对脓毒症小鼠炎症反应的影响及机制研究

郭 茂＊，王文明(泸州市人民医院麻醉科，四川泸州 646000)

目的:研究右美托咪定(Dex)对脓毒症小鼠炎症反应的影响及机制。方法:将小鼠随机分为正常对照组、模型组、微小RNA-146a(m iR-146a)抑制剂(50mg/kg)+Dex(50μg/kg)组和Dex低、中、高剂量组(10、30、50μg/kg)，每组10只。除正常对照组外，其余各组小鼠ip脂多糖建立脓毒症模型，0.5 h后ip相应药物。药物干预6 h后，实时荧光定量聚合酶链式反应法检测各组小鼠外周血单核细胞中m iR-146a表达及其靶基因白细胞介素1(IL-1)受体相关激酶(IRAK1)、肿瘤坏死因子(TNF)受体相关因子6 (TRAF6)mRNA表达，Western blot法检测外周血单核细胞中IRAK1、TRAF6蛋白的表达，酶联免疫吸附法检测血清中TNF-α、IL-6的水平。结果:与正常对照组比较，模型组小鼠的m iR-146a表达增强，TNF-α、IL-6水平升高，IRAK1、TRAF6mRNA和蛋白表达增强(P＜0.01)。与模型组比较，Dex中、高剂量组小鼠外周血单核细胞中m iR-146a表达增强，TNF-α、IL-6水平下降，IRAK1、TRAF6蛋白表达减弱(P＜0.05或P＜0.01)，但IRAK1、TRAF6 mRNA表达变化不明显(P＞0.05)。与Dex高剂量组比较，m iR-146a抑制剂+Dex组小鼠外周血单核细胞中m iR-146a表达减弱，TNF-α、IL-6水平升高，IRAK1、TRAF6蛋白表达增强(P＜0.05或P＜0.01)，但IRAK1、TRAF6mRNA表达变化不明显(P＞0.05)。结论:Dex可抑制脓毒症小鼠炎症反应，其机制可能与诱导m iR-146a表达、抑制Toll样受体4/核因子κB通路中的两个重要接头蛋白IRAKI和TRAF6的表达有关。

脓毒症;右美托咪定;m iR-146a;炎症反应;小鼠;Toll样受体4/核因子κB

脓毒症(Sepsis)是由感染引起的全身炎症反应综合征，病死率高，常发生于严重创伤、烧伤、外科手术后。机体受感染因素刺激后激活体内炎症反应细胞，产生并释放大量炎性介质，其相互作用并级联放大，引起炎症反应失控导致脓毒症的发生。目前关于脓毒症的治疗策略有待深入研究，而阐明与脓毒症密切相关的抗炎因子及其调控机制，无疑有助于脓毒症的有效防治。微小RNA(m icroRNA，miR)是一系列单链非编码RNA，通过使mRNA降解或抑制其翻译调控基因表达，密切参与机体诸多生理、病理过程。研究显示，m iR-146a与脓毒症密切相关，可通过调控重要的炎症Toll样受体4/核因子κB(TLR-4/NF-κB)信号通路发挥抗炎作用[1-2]。右美托咪定(Dexmedetom idine，Dex)系一种高效的α2肾上腺素受体激动药，是临床上应用广泛的麻醉辅助药，具有镇静、镇痛和抗焦虑等作用[3-4]。有研究发现，Dex有良好的抗炎、抗氧化效应，可发挥潜在的器官保护作用[5-6]，那么，Dex的抗炎作用是否与调节m iR-146a相关？本文通过脂多糖(LPS)诱导的小鼠脓毒症模型，研究Dex对脓毒症小鼠外周血单核细胞中miR-146a表达及其靶基因白细胞介素1(IL-1)受体相关激酶(IRAK1)、肿瘤坏死因子(TNF)受体相关因子6(TRAF6)mRNA和蛋白表达，以及血清中炎症因子TNF-α、IL-6水平的影响，进一步探讨Dex对脓毒症小鼠炎症反应的影响及机制。

1 材料

1.1 仪器

TJ-6低温离心机(美国Beckman公司);7500实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)仪(美国ABI公司); H1MF酶标仪(美国Bio-Tek公司);ChemiDoc Touch Western blot检测分析仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 药品与试剂

盐酸Dex注射液(江苏恒瑞医药股份有限公司，批号:09081232，规格:200μg∶2m L);LPS(美国Sigma公司，批号:MFCD00164401，来源于大肠埃希菌O55∶B5，纯度:90%);m iR-146a抑制剂(上海吉玛制药技术有限公司，批号:B03001，纯度:99%);Trizol总RNA提取试剂(美国Invitrogen公司);RIPA细胞裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);兔抗IRAK1、TRAF6多克隆抗体(英国Abcam公司);兔抗β-肌动蛋白(β-actin)多克隆抗体(美国CST公司);辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司); m iRNA qRT-PCR试剂盒(美国GeneCopoeia公司);Ficoll-Paque PREM IUM细胞分离液(瑞典GE公司);荧光定量试剂盒Universal SYBR Green Master(德国Roche公司);TNF-α、IL-6酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(美国R&D Systems公司)。

1.3 动物

SPF级BALB/c小鼠60只，♂，体质量18～22 g，均购自原泸州医学院实验动物中心，使用许可证号:SYXK (川)2013-065。

2 方法

2.1 模型的建立

[7]方法，采用ip LPS建立小鼠脓毒症模型，LPS注射剂量为20mg/kg。小鼠注射LPS后出现寒战、呼吸频率加快、活动力降低、毛发耸立、解稀水样粪便等症状即为脓毒症模型建立成功。

2.2 分组与给药

将60只小鼠随机分为正常对照组、模型组、m iR-146a抑制剂(50mg/kg)+Dex(50μg/kg)组[8]和Dex低、中、高剂量组(10、30、50μg/kg)[9]，每组10只。除正常对照组小鼠ip生理盐水0.2m L外，其余各组小鼠ip LPS建立脓毒症模型;0.5 h后ip相应药物，其中m iR-146a抑制剂ip给药2 h后ip Dex。

2.3 qRT-PCR法检测m iR-146a的表达

给药6 h后，摘除各组小鼠眼球取血，分离外周血单核细胞，提取细胞总RNA，以小核RNA U6(snRNA U6)为内参，qRT-PCR法检测m iR-146a的表达。m iR-146a上游引物为5′-TGAGAACTGAATTCCATGGGTT-3′，下游通用引物由miRNA qRT-PCR试剂盒提供，扩增长度为100 bp;snRNA U6上游引物为5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTAA-3′，下游引物为5′-TATGGAACGCTTCACGAATTTGC-3′，扩增长度为120 bp。扩增条件: 95℃预变性5min;95℃变性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，40个循环。以循环阈值(ct值)为统计参数，采用2-ΔΔct法计算相对表达量。

2.4 Western blot法检测IRAK 1、TRAF6蛋白的表达

将小鼠外周血单核细胞经含蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液裂解，4℃下12 000×g离心5m in，取上清，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取等量蛋白经10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)后，转入聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，于5%脱脂奶粉中室温封闭2 h。将膜分别置于兔抗IRAK1、TRAF6、β-actin多克隆抗体稀释液(稀释比例均为1∶1 000)中，4℃孵育过夜，用PBST(含聚山梨酯20的磷酸盐缓冲液)洗膜3次，每次10m in;再将膜置于HRP标记的山羊抗兔IgG稀释液中(稀释比例为1∶10 000)，室温孵育2 h，PBST洗膜3次，每次10m in。将增强化学发光(ECL)底物滴加至PVDF膜上，通过Western blot检测分析仪收集荧光信号，应用Quantity One软件分析蛋白的灰度值，计算相对表达量。

2.5 qRT-PCR法检测IRAK 1、TRAF6m RNA的表达

根据Trizol总DNA提取试剂说明书提取小鼠外周血单核细胞总RNA，利用PrimeScript RT reagent Kit将所得RNA反转录为cDNA，以β-actin为内参进行RTPCR检测IRAK1、TRAF6 mRNA的表达。引物序列: β-actin上游引物为5′-GATCAAGATCATTGCTCCTCCTGA-3′，下游引物为5′-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3′，扩增长度为125 bp;IRAK1上游引物为5′-CCAACATTCCTTGCTTGCCC-3′，下游引物为5′-TCTCTTGTATACCTGTTCCTGGG-3′，扩增长度为108 bp;TRAF6上游引物为5′-TGAAGGAGAGAATCAGAGCAAG-3′，下游引物为5′-GCCACACAGCAGTCACTTTC-3′，扩增长度为121 bp。扩增条件:95℃预变性5m in;95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环。以循环阈值(ct值)为统计参数，采用2-ΔΔct法计算相对表达量。

2.6 ELISA法检测血清中TNF-α、IL-6水平

采用ELISA法检测各组小鼠血清中TNF-α、IL-6水平，严格按照试剂盒说明书要求操作。

2.7 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计分析。数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 小鼠外周血单核细胞中m iR-146a表达情况

正常对照组、模型组、m iR-146a抑制剂+Dex组和Dex低、中、高剂量组小鼠外周血单核细胞中m iR-146a相对表达量分别为1.06±0.11、3.36±0.25、4.43±0.45、3.60±0.21、5.46±0.39、8.67±0.46(n=10)。与正常对照组比较，模型组小鼠外周血单核细胞中m iR-146a表达增强(P＜0.01)。与模型组比较，Dex中、高剂量组小鼠外周血单核细胞中miR-146a表达增强(P＜0.05或P＜0.01)。与miR-146a抑制剂+Dex组比较，Dex高剂量组小鼠外周血单核细胞中m iR-146a表达增强(P＜0.01)。

3.2 小鼠外周血单核细胞中IRAK 1、TRAF6m RNA及蛋白表达情况

与正常对照组比较，模型组小鼠外周血单核细胞中IRAK1、TRAF6mRNA及蛋白表达增强(P＜0.01)。与模型组比较，Dex中、高剂量组小鼠外周血单核细胞中IRAK1、TRAF6蛋白表达减弱(P＜0.05或P＜0.01)。与miR-146a抑制剂+Dex组比较，Dex高剂量组小鼠外周血单核细胞中IRAK1、TRAF6蛋白表达减弱(P＜0.01)。与模型组比较，m iR-146a抑制剂+Dex组和Dex各剂量组小鼠外周血单核细胞中IRAK1、TRAF6mRNA表达差异均无统计学意义(P＞0.05)。各组小鼠外周血单核细胞中IRAK1、TRAF6mRNA及蛋白表达的测定结果见表1。

表1 各组小鼠外周血单核细胞中IRAK 1、TRAF6 m RNA及蛋白表达的测定结果(±s，n=10)Tab 1 Determ ination results of IRAK 1，TRAF6m RNA and protein exp ressions in them ice peripheral blood mononuclear cells of each group(±s，n=10)

表1 各组小鼠外周血单核细胞中IRAK 1、TRAF6 m RNA及蛋白表达的测定结果(±s，n=10)Tab 1 Determ ination results of IRAK 1，TRAF6m RNA and protein exp ressions in them ice peripheral blood mononuclear cells of each group(±s，n=10)

注:与正常对照组比较，＊＊P＜0.01;与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01;与miR-146a抑制剂+Dex组比较，ΔΔP＜0.01Note:vs.normal control group，＊＊P＜0.01;vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01;vs.m iR-146a inhibitor+Dex group，ΔΔP＜0.01

TRAF6组别mRNA相对表达量IRAK1TRAF6蛋白相对表达量IRAK1 1.29±0.30 3.40±0.66＊＊3.26±0.56 3.22±0.67 2.79±0.56#2.08±0.58##△△正常对照组模型组miR-146a抑制剂+Dex组Dex低剂量组Dex中剂量组Dex高剂量组1.07±0.13 3.75±0.42＊＊3.97±0.38 3.66±0.45 3.55±0.41 3.54±0.43 1.08±0.15 4.24±0.46＊＊4.41±0.51 4.01±0.42 3.96±0.67 3.88±0.48 1.81±0.68 3.93±0.55＊＊3.50±0.47 3.79±0.21 3.29±0.49#2.30±0.46##△△

3.3 小鼠血清中TNF-α、IL-6水平变化

与正常对照组比较，模型组小鼠血清中TNF-α、IL-6水平升高(P＜0.01)。与模型组比较，Dex中、高剂量组小鼠血清中TNF-α、IL-6水平降低(P＜0.05或P＜0.01)。与miR-146a抑制剂+Dex组比较，Dex高剂量组小鼠血清中TNF-α、IL-6水平降低(P＜0.05)。各组小鼠血清中TNF-α、IL-6水平的测定结果见表2。

4 讨论

炎症因子的适度释放是机体对抗外界刺激、发挥自身免疫功能所必需的，但是过度的炎症反应会形成炎症“瀑布”反应，则易导致脓毒症的发生。重要的促炎因子TNF-α主要由单核-巨噬细胞产生，是炎症反应中释放最早的重要内源性炎症因子之一，可直接损伤血管内皮细胞，并刺激IL-6等炎症因子产生。IL-6也是重要的促炎因子，是反映组织损伤程度的早期敏感性指标。有效抑制炎症因子的释放是脓毒症治疗的重要策略。目前的研究发现，Dex可通过抗交感、抑制细胞炎症和凋亡、抑制氧化应激反应、激活细胞保护信号通路等多种途径对机体多脏器如脑、心、肺和肾发挥潜在的器官保护效应[10]，但Dex的抗炎机制仍需要深入研究。本研究结果表明，Dex可降低脓毒症小鼠血清中TNF-α和IL-6的水平，减弱其炎症反应。

表2 各组小鼠血清中TNF-α、IL-6水平的测定结果(±s，n=10)Tab 2 Determ ination results of TNF-α，IL-6 levels in them ice serum ofeach grou(p±s，n=10)

表2 各组小鼠血清中TNF-α、IL-6水平的测定结果(±s，n=10)Tab 2 Determ ination results of TNF-α，IL-6 levels in them ice serum ofeach grou(p±s，n=10)

注:与正常对照组比较，＊＊P＜0.01;与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01;与m iR-146a抑制剂+Dex组比较，ΔP＜0.05Note:vs.normal control group，＊＊P＜0.01;vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01;vs.miR-146a inhibitor+dexmedetomidine group，ΔP＜0.05

组别正常对照组模型组miR-146a抑制剂+Dex组Dex低剂量组Dex中剂量组Dex高剂量组IL-6，pg/mL 20.06±3.59 141.15±17.49＊＊105.55±11.93 129.55±22.89 83.97±14.44#40.42±6.10##△TNF-α，pg/mL 35.33±4.04 580.86±35.13＊＊327.06±16.82 562.24±33.44 480.17±40.97#199.97±20.90##△

TLR4/NF-κB信号通路可促使大量炎症介质的产生释放，是诱导脓毒症发生的重要信号通路。LPS与TLR4结合并活化TLR4，与髓样分化蛋白88结合，进一步活化IRAK1、TRAF6，最后活化NF-κB抑制蛋白IκB激酶并降解IκB，使NF-κB激活，发生核转位，启动炎症基因转录及翻译。

研究显示，m iR-146a的表达在脓毒症患者中显著增强，可作为潜在的判断脓毒症预后的指标[11]。miR-146a的靶基因是TLR4/NF-κB通路中的两个重要接头蛋白IRAK1和TRAF6，m iR-146a通过抑制IRAK1和TRAF6蛋白的表达，负性调控TLR4/NF-κB通路，抑制炎症反应[12]。本研究发现，Dex可增强脓毒症小鼠外周血单核细胞中miR-146a表达，并相应地抑制m iR-146a靶基因——炎症信号TLR4/NF-κB通路中重要的接头蛋白IRAK1和TRAF6的表达;同时，抑制miR-146a活性后，Dex的抗炎效应显著减弱，提示Dex的抗炎活性部分由诱导抗炎分子m iR-146a介导。

综上所述，Dex可通过诱导m iR-146a表达，下调IRAK1和TRAF6的表达，进而负性调控TLR4/NF-κB通路，并抑制炎症因子TNF-α和IL-6的释放，从而在脓毒症小鼠中发挥重要的抗炎效应，揭示了Dex抗炎作用的新机制。

参考文献

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(编辑:邹丽娟)

Study on the Effect and Its M echanism of Dexmedetom idine on the Inflammatory Response in Septic M ice

GUO Mao，WANG Wenm ing(Dept.of Anesthesiology，Luzhou People’s Hospital，Sichuan Luzhou 646000，China)

OBJECTIVE:To study the effect and itsmechanism of dexmedetomidine(Dex)on inflammatory response in septic m ice.METHODS:M ice were random ly divided into normal control group，model group，m iR-146a inhibitor(50 mg/kg)+Dex (50μg/kg)group，Dex low-dose，medium-dose，high-dose groups(10，30，50μg/kg)，10 in each group.Except for normal control group，other groups were intraperitoneally injected lipopolysaccharide to induce septic models，intraperitoneally injected relevantmedicines after 0.5 h.A fter drug intervention for 6 h，m iR-146a expression，IRAK1 and TRAF6 mRNA expressions in peripheral blood mononuclear cells in each group were detected by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction method. IRAK1，TRAF6 protein expressions in peripheral blood mononuclear cells in each group were detected by Western blot method. TNF-α，IL-6 levels in serum were detected by enzyme-linked immunosorbentmethod.RESULTS:Compared w ith normal control group，m iR-146a expression，TNF-αand IL-6 levels，IRAK1，TRAF6 mRNA and protein expressions in peripheral blood mononuclear cells inmodel group were increased(P＜0.01).Compared w ithmodel group，miR-146a expression in peripheral blood mono-nuclear cells in Dex medium-dose，high-dose groups were increased;TNF-αand IL-6 levels，IRAK1，TRAF6 protein expressions were decreased(P＜0.05 or P＜0.01);while IRAK1，TRAF6 mRNA expressions changed less obviously(P＞0.05).Compared w ith Dex high-dose group，miR-146a expression，in peripheral blood mononuclear cells in miR-146a inhibitor+Dex group was decreased;TNF-αand IL-6 levels，IRAK1，TRAF6 protein expressions were increased(P＜0.05 or P＜0.01);while IRAK1，TRAF6 mRNA expressions changed less obviously(P＞0.05).CONCLUSIONS:Dex can inhibit the inflammatory response in septic m ice.Themechanism may associate w ith inducing m iR-146a expression and inhibiting the 2 important adaptor proteins IRAK1，TRAF6 expressions in Toll-like receptor 4/nuclear factor-κB pathway.

Sepsis;Dexmedetomidine;miR-146a;Inflammatory response;M ice;Toll-like receptor 4/nuclear factor-κB

R971+.2

A

1001-0408(2017)19-2651-04

2016-12-22

2017-03-10)

＊主治医师。研究方向:临床麻醉。电话:0830-2361931。E-mail:guomaolzyxy@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.17