麻黄附子细辛汤抗过敏性鼻炎有效组分的组方研究Δ

2017-08-11师大智谭晓梅黄茵茵夏曼丽南方医科大学中医药学院广东省中药制剂重点实验室广州510515

中国药房 2017年19期

黄瑶，师大智，谭晓梅，黄茵茵，夏曼丽(南方医科大学中医药学院/广东省中药制剂重点实验室，广州510515)

黄瑶＊，师大智，谭晓梅#，黄茵茵，夏曼丽(南方医科大学中医药学院/广东省中药制剂重点实验室，广州510515)

目的:研究抗过敏性鼻炎(AR)中药有效组分的新组方，为抗AR现代中药制剂的开发提供参考。方法:以麻黄附子细辛汤中盐酸伪麻黄碱(0～13.5mg/kg)、附子总碱提取物(0～21.18mg/kg)和细辛挥发油(0～0.009 2m L/kg)为组方对象，采用均匀设计法进行分组给药，对AR豚鼠给药前后行为学积分、血清中组胺和免疫球蛋白E(IgE)的含量进行多元回归分析，以获得最佳组方。分别以辛芩颗粒、氯雷他定片和麻黄附子细辛汤为阳性对照，以AR豚鼠给药前后行为学积分、血清中组胺和IgE含量对最佳组方的药效进行验证;并通过小鼠急性毒性实验初步观察最佳组方的安全性。结果:最佳组方为盐酸伪麻黄碱11.25mg/kg、附子总碱提取物21.18mg/kg、细辛挥发油0.004 5m L/kg。最佳组方组豚鼠给药前后行为学积分与各阳性药物组比较均无统计学差异(P＞0.05)，血清中组胺含量较辛芩颗粒组和麻黄附子细辛组显著降低(P＜0.05)，血清中IgE含量较辛芩颗粒和氯雷他定片组显著降低(P＜0.05)。最佳组方的半数致死量为1 822.04mg/kg。结论:本研究筛选的最佳组方在减少血清中组胺含量方面较辛芩颗粒和麻黄附子细辛汤效果更佳，在减少血清中IgE含量方面较氯雷他定片和辛芩颗粒效果更佳，且安全性较好，在一定程度上说明了中药有效成分组方的可行性。

麻黄附子细辛汤;均匀设计;盐酸伪麻黄碱;附子总碱提取物;细辛挥发油;过敏性鼻炎;豚鼠

过敏性鼻炎(Allergic rhinitis，AR)是一种常见的耳鼻喉科变应性疾病，发病率高且逐年上升[1]。现代治疗方法多为药物治疗，其中化学药主要有抗组胺药等，但长时间服用副作用较多、维持时间短且易复发[2];而采用中医辨证论治，疗效确切[3-4]。麻黄附子细辛汤为张仲景《伤寒论》中名方，现代临床上广泛用于哮喘、AR、支气管炎等疾病的治疗[5]。但传统方剂成分复杂、作用机制不明确，难以实现国际化。本课题组前期对麻黄附子细辛汤的物质基础及作用机制进行了研究，明确了附子总碱及细辛挥发油为麻黄附子细辛汤抗AR的活性部位[6-7]，麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱、新乌头碱、乌头碱和甲基丁香酚等为其有效成分[8-9]。本研究拟用均匀设计法对麻黄附子细辛汤中作用机制较明确的组分(盐酸伪麻黄碱、附子总碱提取物和细辛挥发油)进行组方研究，以期为开发疗效更优、物质基础及作用机制相对清楚的抗AR现代中药复方新制剂提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器

iM ark酶标仪(美国Bio-Rad公司);PL602-S电子天平[梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司];CP324S电子微量天平(德国赛多利斯集团);Scanspeed 1730R低温离心机(丹麦LaboGene公司)。

1.2 药材、药品与试剂

麻黄(Ephedra sinica Stapf，产地:吉林，批号:101001)、细辛(Asarum sieboldii M iq.，产地:辽宁，批号:150401)均购自广州至信中药饮片有限公司;制附子(Aconitum carmichaeli Debx.，产地:四川，批号:150110481)购自康美药业股份有限公司。以上药材经南方医科大学中药鉴定教研室马骥教授鉴定均为真品。

辛芩颗粒(四川志远广和制药有限公司，批号: 20150101，规格:5 g/袋);氯雷他定片(广东逸舒制药有限公司，批号:20150101，规格:10mg/片);盐酸伪麻黄碱原料药(赤峰艾克制药科技股份有限公司，批号: 20080401，纯度:≥98%);豚鼠组胺、免疫球蛋白E(IgE)试剂盒(上海邦奕生物科技有限公司，批号:BYE40023、BYE40003);氢氧化铝、氯仿、乙醇等均为分析纯。

1.3 动物

FMMU豚鼠130只，♀♂各半，体质量250～300 g，普通级;KM小鼠80只，♀♂各半，体质量18～22 g，SPF级。以上动物均由南方医科大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK(粤)2011-0015。

2 方法

2.1 麻黄附子细辛汤、附子总碱提取物和细辛挥发油的制备

2.1.1 麻黄附子细辛汤取麻黄60 g，加水2 700m L浸泡30m in，武火煮沸，煎煮20m in，去沫;再加入制附子90 g和细辛30 g，煎煮90m in，过滤，浓缩至200m L，制备成生药量为0.9 g/m L的麻黄附子细辛汤。

2.1.2 附子总碱提取物参考文献[6]中方法，称取制附子粗粉1 000 g，加10倍量85%乙醇(盐酸调pH为2～3)，加热回流提取2 h，过滤;滤渣加8倍量85%乙醇(盐酸调pH 2～3)加热回流提取1 h，过滤;合并2次滤液，将滤液浓缩至无醇味，约500m L。浓缩液用氨水调pH值至10，加2倍氯仿萃取3次，合并氯仿层，回收氯仿，得附子总生物碱浸膏9.37 g。

2.1.3 细辛挥发油按2015年版《中国药典》“通则2204”中挥发油测定法[10]进行挥发油提取。取细辛粗粉400 g，加8倍量水，浸泡1 h，水蒸气蒸馏提取8 h，得挥发油8.4m L。

2.2 均匀设计试验方案

结合附子(3 g/d)和细辛(15 g/d)药材临床最大剂量和盐酸伪麻黄碱(180mg/d)临床常用剂量，换算成豚鼠等效剂量后设置3个有效组分的最大剂量，确定各有效组分的各水平相等(水平数均为6)。为使各因素的水平数与因素数之比不小于2，并考虑到组方优选的实际需要及实验的可操作性(取样误差在5%范围内)，选用均匀设计表U6(62×32)分成6个药物剂量配比进行配伍组方，得均匀设计实验表，详见表1。

表1 均匀设计试验表Tab 1 Tableofuniform design test

2.3 有效组分组方筛选实验

2.3.1 AR模型制备每只豚鼠给予致敏液(每1m L生理盐水中加入卵清蛋白0.3mg和氢氧化铝粉末30mg)，隔天ip 1次，共7次，作为基础致敏;并在基础致敏后，以2 g/L卵清蛋白生理盐水溶液滴鼻强化致敏[6]。

2.3.2 症状分级标准每次强化致敏后观察并记录30 m in内豚鼠的鼻痒、鼻涕和喷嚏次数，计算豚鼠AR行为学积分，总分超过5分即为动物模型成功[11]。AR症状分级标准见表2。

表2 豚鼠AR症状分级标准Tab 2 AR sym ptom sgrading standardsof guinea pig

2.3.3 疗效评定标准参考1997年在海口修订的AR诊断标准和疗效评定标准，治疗后AR行为学积分累计减少2分或3分为显效，减少1分为有效[11]。

2.3.4 动物分组、给药与指标检测将豚鼠随机分为空白对照组、模型组和均匀设计配方6组，共8组，每组10只，将除空白组外的其余70只豚鼠按“2.3.1”项下方法进行造模。选取造模成功后的AR豚鼠(每组6只)按照均匀设计表配方ig给药，空白对照组和模型组豚鼠ig等体积生理盐水，连续给药10 d。除正常对照组外，其余各组豚鼠给药期间隔日给予卵清蛋白2 g/L滴鼻以维持对鼻黏膜的刺激，观察并记录滴鼻30min内豚鼠搔鼻次数、鼻涕程度和喷嚏次数。给药10 d后，豚鼠ip 3%戊巴比妥钠2m L麻醉，腹主动脉取血，血液静置2 h后以离心半径4 cm、3 000 r/min离心10m in，分离血清，按照相应试剂盒说明书操作测定血清中组胺和IgE含量。以相应指标水平为纵坐标(y)对各组分用量进行多元回归分析，以获得最佳组方。

2.4 最佳组方的药效验证实验

取豚鼠56只，其中50只进行造模，6只为空白对照。造模方法和评价方法同“2.3.1”“2.3.2”项下。将造模成功的AR豚鼠随机分成模型组、最佳组方组、辛芩颗粒组(0.75mg/kg，根据临床等效剂量换算而得)、氯雷他定片组(0.167mg/kg，根据临床等效剂量换算而得)和麻黄附子细辛汤组(1.35 g/kg，根据临床等效剂量换算而得)，每组6只。空白对照组和模型组豚鼠ig蒸馏水，其余各组ig相应药物，每天1次，连续10 d。除空白对照组外，其余各组豚鼠给药期间隔日给予卵清蛋白2 g/L滴鼻以维持对鼻黏膜的刺激，观察并记录滴鼻后30min内豚鼠抓鼻次数、鼻涕程度和喷嚏次数。末次给药后，豚鼠ip 3%戊巴比妥钠2m L麻醉，腹主动脉取血，血液静置2 h后以离心半径4 cm、3 000 r/min离心10m in，分离血清，按照试剂盒说明操作测定血清中组胺和IgE含量。

2.5 最佳组方的急性毒性实验

取最佳组方进行急性毒性实验，探索最佳组方的急性毒性。取小鼠80只随机分为1～8组，每组10只，分别按照最佳组方剂量的12、15、19、24、30、38、47、59倍(分别为805.32、1 007.31、1 259.14、573.92、1 976.58、2 471.05、3 088.82、3 861.35mg/kg)一次性ig给药，观察7 d内各组小鼠的情况，计算死亡率。

2.6 统计学方法

采用DPS 7.05统计软件对均匀设计结果进行多元回归分析。计量资料以±s表示，采用SPSS 20.0进行方差分析和组间两两比较，并计算半数致死剂量(LD50)及95%置信区间。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 有效组分组方筛选结果

各组豚鼠给药前后的行为学积分以及血清中组胺、IgE含量测定结果见表3。

表3 各组豚鼠行为学积分以及血清中组胺、IgE含量测定结果(±s，n=6)Tab 3 Results of behavioral scores，and histam ine，IgE contents in serum of guinea pigs in each grou(p±s，n=6)

注:与空白组对照组比较，＊P＜0.05;与模型组比较，#P＜0.05Note:vs.blank controlgroup，＊P＜0.05;vs.modelgroup，#P＜0.05

组别空白对照组模型组均匀设计组方1均匀设计组方2均匀设计组方3均匀设计组方4均匀设计组方5均匀设计组方6血清中组胺含量，μg/L 2.77±0.26 5.46±0.23＊2.35±0.22#2.56±0.45#2.47±0.25#2.73±0.32#3.14±0.55#3.12±0.12#给药前行为学积分1.89±0.33 5.50±0.55＊5.14±0.52＊5.05±0.53＊5.44±0.53＊5.67±0.50＊5.11±0.33＊5.22±0.44＊给药后行为学积分1.20±0.63 5.10±0.32＊2.38±0.52#2.14±0.38#2.30±0.82#2.22±0.67#2.00±0.67#1.43±0.54#血清中IgE含量，μg/mL 16.53±0.96 34.57±1.76＊16.33±0.80#16.54±0.90#14.79±1.70#15.92±1.13#18.28±1.62#17.68±1.58#

由表3可见，模型组与空白对照组豚鼠给药前后的行为学积分、血清中组胺和IgE含量有显著性差异(P＜ 0.05)，说明模型成功。在模型成功的基础上，由于行为学积分离散性较大，故将其作为辅助观察指标;对血清中组胺和IgE含量采用DPS 7.05软件进行二次多项式逐步回归分析，具体方程见表4。

表4 血清中组胺和IgE含量的回归方程Tab 4 Regression equations of histam ine，IgE contents in serum

由上述方程可知，X1、X2对方程有显著性影响，X3对方程无显著性影响。根据行为学积分、血清中组胺和IgE含量等结果采用DPS 7.05软件分析得出的最佳配伍剂量以0.2∶0.4∶0.4进行加权计算(其中按行为学积分得出的最佳剂量为伪麻黄碱13.50mg/kg、制附子总碱提取物21.18mg/kg、细辛挥发油0.001 5m L/kg;按血清中组胺含量计算得出最佳剂量为伪麻黄碱12.56mg/kg、附子总碱提取物21.18mg/kg、细辛挥发油0.006 0m L/kg;按血清中IgE含量得出最佳剂量为伪麻黄碱8.82mg/kg、附子总碱提取物21.18 mg/kg、细辛挥发油0.004 5 m L/kg)，得有效组分最佳组方剂量，即伪麻黄碱11.25 mg/kg、附子总碱提取物21.18mg/kg、细辛挥发油0.004 5 m L/kg。

3.2 最佳组方药效验证实验结果

给药前，各造模组豚鼠的AR症状加重，行为学积分较空白对照组显著升高(P＜0.05)。给药后，在AR豚鼠行为学方面，各给药组豚鼠的行为学积分与模型组比较均显著降低(P＜0.05)，与空白对照组比较均无统计学差异(P＞0.05)，且最佳组方组与麻黄附子细辛汤组、辛芩颗粒组和氯雷他定片组比较也均无统计学差异(P＞0.05);在血清组胺方面，各给药组豚鼠血清中组胺含量较模型组均显著降低(P＜0.05)，其中最佳组方组豚鼠血清中组胺含量比空白对照组、辛芩颗粒组和麻黄附子细辛汤组更低(P＜0.05)，与氯雷他定片组比较无统计学差异(P＞0.05);在血清IgE方面，各给药组豚鼠血清中IgE含量较模型组均显著降低(P＜0.05)，且最佳组方组豚鼠血清中IgE含量比空白对照组、辛芩颗粒组和氯雷他定片组更低(P＜0.05)，与麻黄附子细辛汤组比较无统计学差异(P＞0.05)，结果详见表5。

3.3 最佳组方急性毒性实验结果

给药后，各组小鼠均较兴奋，出现死亡情况的小鼠给药后全身毛乍起，笼内翻滚后抽搐死亡(1～8组小鼠死亡只数分别为0、1、3、5、6、7、8、9只)，大部分小鼠有举尾反应现象。最佳组方的LD50为1 822.04mg/kg，95%置信区间为1 516.74～2 189.10mg/kg。

4 讨论

AR是一种由于吸入过敏原导致的过敏性免疫反应。当过敏原接触鼻腔黏膜后，Th2细胞(2型辅助T细胞)产生白细胞介素4等细胞因子诱导B淋巴细胞合成过敏原特异性IgE;当机体再次接触过敏原后，过敏原与肥大细胞表面IgE受体结合，导致肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒释放组胺等炎症介质，引发机体流清涕、打喷嚏等AR症状[12]，故检测血清中的组胺和IgE含量变化能间接反映药物的治疗效果。

表5 药效验证实验中各组豚鼠行为学积分以及血清中组胺、IgE含量测定结果(±s，n=6)Tab 5 Results of behavioral scores，and histam ine，IgE contents in serum of guinea pigs in each group in theefficacy verification tes(t±s，n=6)

注:与空白对照组比较，＊P＜0.05;与模型组比较，#P＜0.05;与最佳组方组比较，ΔP＜0.05Note:vs.blank control group，＊P＜0.05;vs.model group，#P＜0.05;vs.best formulagroup，ΔP＜0.05

组别空白对照组模型组最佳组方组辛芩颗粒组氯雷他定片组麻黄附子细辛汤组血清中IgE含量，μg/mL 2.773±0.262 5.463±0.234＊2.389±0.517＊#3.102±0.310#△3.095±0.395#△3.677±0.550#给药前行为学积分1.000±0.632 5.333±0.516＊5.125±0.354＊5.333±0.516＊5.167±0.408＊5.167±0.408＊给药后行为学积分1.167±0.753 5.000±0.000＊2.375±0.517#2.500±0.548#2.167±1.169#2.667±0.516#血清中组胺含量，μg/L 16.173±0.769 34.568±1.764＊14.475±0.752＊#17.435±1.518#△17.283±1.840#15.585±1.113#△

由于传统方剂药物成分复杂、药味较多且物质基础不明确，阻碍了传统方剂的应用。为了促进现代中药新制剂的研制，王永炎院士提出了中药有效组分配伍的新思路[13]。为了得到最优配伍比例，均匀设计、正交设计等数学方法被用于实验研究[14]。其中均匀设计能用较少的实验次数得到较多的数据，适合用于中药有效组分配伍的优化[15-16]。本研究从本课题组前期得到的3种已知的有抗AR药效且作用机制较清楚的有效组分(盐酸伪麻黄碱、附子总碱提取物及细辛挥发油)[6-7]，采用均匀设计得到最佳药效组方。并以临床常用抗AR化学药氯雷他定片、中成药辛芩颗粒和麻黄附子细辛汤原方为对照，对其进行药效验证后发现最佳组方在减少血清中组胺含量方面较辛芩颗粒和麻黄附子细辛汤效果更佳，在减少血清中IgE含量方面较氯雷他定片和辛芩颗粒效果更佳，这说明最优组方可能是通过抑制组胺的释放和IgE的合成而发挥抗AR作用。根据小鼠急性毒性实验结果可知，最佳组方的最大安全剂量(805.32mg/kg)和LD50(1 822.04mg/kg)分别为最佳组方剂量的12、27倍，初步说明最佳组方安全性较好。

综上所述，基于传统方剂理论得到的麻黄附子细辛汤有效组分组方可以达到原方汤剂的疗效，也说明了采用有效组分组方进行抗AR中药新制剂研发的可行性。然而本研究中仍有一些不足，有待进一步完善。如从验证实验结果中发现最佳组方组豚鼠给药10 d后血清中IgE、组胺含量比空白对照组显著降低(P＜0.05)，但本研究未对该现象作进一步探索;又如本研究仅对最佳组方进行了急性毒性实验，不能全面反映其安全性。故后期可从最佳组方的给药时间、长期毒性等方面进行研究，明确最佳的给药方案，全面评价最佳组方的安全性。

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Study on the Effective Com ponent Form ula of M ahuang Fuzi Xixin Decoction for Anti-allergic Rhinitis

HUANG Yao，SHIDazhi，TAN Xiaomei，HUANG Yinyin，XIA Manli(School of TCM，Southern Medical University/Guangdong Province Key Lab of TCM Preparations，Guangzhou 510515，China)

OBJECTIVE:To study the new formula of effective components in TCM for anti-allergic rhinitis(AR)，and provide reference for developing TCM preparations for anti-AR.METHODS:Using pseudoephedrine hydrochloride(0-13.5 mg/kg)，total alkaloid extracts of Aconitum carmichaelii(0-21.18 mg/kg)，volatile oilof asari radix(0-0.009 2 m L/kg)in Mahuang Fuzi Xixin decoction as formula objects，uniform design method was used for drug grouping，and multiple regression analysis was conducted for the behavioral scores before and after adm inistration，contents of histamine and immunoglobulin E(IgE)in serum of AR guinea pigs to obtain the best formula.Using Xinqin granule，Loratadine tablet，Mahuang Fuzi Xixin decoction respectively as positive control，efficacy of the best formula was verified from aspects of behavioral scores before and after administration，contents of histam ine and IgE of AR guinea pigs.And the safety of the best formula was prelim inarily observed through acute toxicity test in m ice.RESULTS:The best formula was as follow as pseudoephedrine hydrochloride 11.25 mg/kg，total alkaloid extracts of A.carmichaelii 21.18 mg/kg，volatile oilof asari radix 0.004 5 m L/kg.Compared w ith each positive drug group，there were no significant differences in behavioral scores before and after administration in the best formula group(P＞0.05).While compared w ith Xinqin granule group and Mahuang Fuzi Xixin decoction group，histamine content in serum in the best formula group was significantly reduced(P＜0.05);compared w ith Xinqin granule and Loratadine tablet group，IgE content in serum in the best formula group was significant decreased(P＜0.05).Median lethal dose of the best formula was 1 822.04 mg/kg.CONCLUSIONS:The screened best formula shows better effect than Xinqin granule and Mahuang Fuzi Xixin decoction in terms of reducing histam ine content in serum，better than Loratadine tablet and Xinqin granule in terms of reducing IgE content in serum，w ith good safety，which indicates the feasibility of TCM effective component formula to a certain degree.

Mahuang Fuzi Xixin decoction;Uniform design;Pseudoephedrine hydrochloride;Total alkaloid extracts of Aconitum carmichaelii;Volatile oilof asari radix;A llergic rhinitis;Guinea pigs

R283;R285

1001-0408(2017)19-2635-04

2016-12-02

2017-04-11)

(编辑:林静)

广州市科技计划项目(No.201707010042)

＊硕士研究生。研究方向:中药新制剂的研究。电话:020-62789112。E-mail:yhuang1993@163.com

#通信作者:研究员，博士生导师。研究方向:中药新制剂、新剂型的研究。电话:020-61648265。E-mail:txm@fimmu.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.12