基于道南效应和溶解扩散效应分析低浓度乙醇中绿原酸的纳滤分离规律

李存玉　刘莉成　金立阳　李红阳　彭国平

[摘要]该文采用纳滤分离低浓度乙醇中绿原酸，探索道南效应和溶解扩散效应对绿原酸分离的影响规律。实验表明溶液pH、乙醇浓度影响绿原酸分离行为，30%乙醇中绿原酸pH 3～7，截留率相差7027%，通过响应面法建立二次回归模型，纳滤膜截留相对分子质量、溶液pH、乙醇浓度存在交互作用，绿原酸存在状态决定了其分离行为，随着乙醇浓度的增加，游离态绿原酸因溶解扩散效应易吸附溶解在膜表面而促进其透过，解离态绿原酸在道南效应和溶解扩散效应的双重作用下，难以进入膜表面，而截留率显著升高。优选出的纳滤富集工艺相较于传统减压浓缩优势明显，解决了中药分离精制过程中，低浓度有机试剂环境中中药成分在溶剂回收时存在效率低下、成分损失严重的技术难题。

[关键词]绿原酸； 纳滤； 乙醇，道南效应； 溶解扩散效应

[Abstract]To separate chlorogenic acid from low concentration ethanol and explore the influence of Donnan effect and solutiondiffusion effect on the nanofiltration separation rule The experiment showed that solution pH and ethanol volume percent had influences on the separation of chlorogenic acid Within the pH values from 3 to 7 for chlorogenic acid in 30% ethanol， the rejection rate of chlorogenic acid was changed by 7027% Through the response surface method for quadratic regression model， an interaction had been found in molecule weight cutoff， pH and ethanol volume percent In fixed nanofiltration apparatus， the existence states of chlorogenic acid determinedits separation rules With the increase of ethanol concentration， the free form chlorogenic acid was easily adsorbed， dissolved on membrane surface and then caused high transmittance due to the solutiondiffusion effect However， at the same time， due to the double effects of Donnan effect and solutiondiffusion effect， the ionic state of chlorogenic acid was hard to be adsorbed in membrane surface and thus caused high rejection rate The combination of BoxBehnken design and response surface analysis can well optimize the concentrate process by nanofiltration， and the results showed that nanofiltration had several big advantages over the traditional vacuum concentrate technology， meanwhile， and solved the problems of low efficiency and serious component lossesin the Chinese medicines separation process for low concentration organic solventwater solution

[Key words]chlorogenic acid； nanofiltration； ethanol； Donnan effect； solutiondiffusion effect

中藥分离精制过程中，含有低浓度有机试剂的中间体在溶剂回收时存在效率低下、成分损失严重的技术难题。如柱色谱分离时采用不同浓度有机溶剂洗脱，洗脱液中有机溶剂浓度偏低时需要高温回收溶剂，对富含酚酸等热敏性成分具有破坏，且难以控制成分转化而影响分离效率，目前尚未出现适用可行的技术手段 [1]。纳滤是膜分离技术中的一种，截留相对分子质量在100～1 000，具有分离过程可常温操作，无热效应，能耗低等技术优势[2]，在热敏性中药成分分离精制领域具有独特优势[3]。纳滤对溶质分子的分离原理主要包含道南效应和溶解扩散效应，其中道南效应又称电荷效应，纳滤膜荷负电性，与离子间形成静电作用，加上立体阻碍，造成膜对离子的截留率有差异；在含不同价态离子的多元体系中，道南效应使得膜对不同离子的选择性不一样。此外，由于纳滤膜孔与溶质分子的相互作用，也呈现出在位阻效应基础上的溶解扩散理论，溶质溶解在膜中，并随着推动力扩散传递，物相之间存在化学平衡。但目前对低浓度有机溶剂处理尚处于初步阶段[4]，且分离机制不清晰。本文以富含酚酸的金银花为例，探索低浓度乙醇环境中的绿原酸分离规律。

金银花为忍冬Lonicera japonica的干燥花蕾或带初开的花，因具有清热解毒、疏散风热等功效[5]而广泛用于临床，如清开灵注射液、银黄注射液等。金银花中主要成分是以绿原酸为代表的酚酸，热稳定性差，长时间加热易分解[6]，本文结合纳滤分离的技术优势，在单因素考察的基础上，以纳滤截留相对分子质量、乙醇浓度及pH为影响因子，应用BoxBehnken中心组合设计建立数学模型[7]，以绿原酸截留率作为响应值，利用响应面分析软件分析，优选纳滤浓缩工艺参数，同时与常规浓缩工艺对比，分析纳滤浓缩的可行性，从而为低浓度有机水溶液中药物成分精制纯化提供技术支撑。

1材料

金银花药材购自安徽惠隆中药饮片有限公司，批号20150702，经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为忍冬科植物忍冬L japonica的干燥花蕾。

复合聚酰胺纳滤膜，截留相对分子质量100，450，800（南京拓鉒医药科技有限公司）；绿原酸对照品（批号110753200413，质量分数≥98%），购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

Agilent 1100高效液相色谱仪，VWD检测器（美国安捷伦公司）；TNZ1纳滤分离设备（南京拓鉒医药科技有限公司）；RE2000B型旋转蒸发仪（南京科尔仪器设备有限公司）；SHBⅢ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；PB10型pH计（德国Sartorius公司）；KH250B型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。

2方法

21金银花供试品溶液

称取金银花药材适量，分别加入10，8倍纯化水提取，每次1 h，045 μm微孔滤膜过滤，合并滤液，液相检测绿原酸浓度，进而按照试验设计加入乙醇试剂，在保持绿原酸浓度不变的前提下，调节金银花提取液中乙醇浓度达到试验需求。

22纳滤操作

组装纳滤膜与TNZ1纳滤分离设备，取金银花供试品溶液置于纳滤系统中进行循环平衡，待绿原酸在纳滤膜中的吸附解吸附达到平衡时，取样平衡液，进而将溶液进行纳滤，待纳滤完成后，取样纳滤液。

23pH对绿原酸截留率的影响

在相同绿原酸浓度条件下，选择金银花10%乙醇为供试品溶液，调节pH为2，3，4，5，6，7，8，采用截留相对分子质量450的纳滤膜进行富集浓缩，待纳滤完成后，根据平衡液及纳滤液中绿原酸浓度，分析pH对绿原酸截留率的影响。

24乙醇浓度对绿原酸截留率的影响

在相同绿原酸浓度条件下，pH为3，5，7，调节乙醇浓度分别为0，5%，10%，20%，30%的金银花供试品溶液，采用截留相对分子质量450的纳滤膜进行富集浓缩，待纳滤完成后，根据平衡液及纳滤液中绿原酸浓度，分析乙醇浓度对绿原酸截留率的影响。

25响应曲面试验设计分析因素交互作用

对含有有机试剂的金银花提取物溶液进行纳滤富集，其中乙醇浓度和溶液pH对绿原酸截留率具有一定影响，且二者存在交互作用，基于此采用DesignExpert 806软件，根据中药提取液在膜分离精制过程中的关键影响因素：纳滤膜截留相对分子质量、乙醇浓度、溶液pH作为变量，以-1，0，1代表变量水平，进行BoxBehnken设计三因素三水平實验方案，见表1。

26减压浓缩对比

根据响应面实验优选出的对乙醇浓度参数，配置金银花提取物溶液进行减压浓缩，操作压力-010 MPa，温度80 ℃，取金银花提取物溶液1 000 mL浓缩至100 mL，分析减压浓缩对绿原酸转移率的影响。

27绿原酸检测

按照2015年版《中国药典》一部，金银花含量测定项下方法测定。

271色谱条件Hanbon Hedera ODS2色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm），流动相乙腈04%磷酸溶液（13∶87），检测波长327 nm，流速1 mL·min-1，理论塔板数按绿原酸计算应不低于1 000。

272对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品0020 1 g，置10 mL量瓶中，用流动相溶解并制成每1 mL含绿原酸201 mg的溶液。

273线性关系精密吸取绿原酸对照品溶液 005，010，020，050，100，200 mL 分别置于20 mL的量瓶中，流动相定容至刻度，Agilent 1100高效液相色谱仪检测，以峰面积为纵坐标（Y），对照品溶液浓度为横坐标（X），得线性回归方程Y=1032X-1101，R2=0999 4。绿原酸在5025～201 mg·L-1，线性关系良好。

274样品测定取待测样品按271项下的色谱条件，进样量10 μL，高效液相色谱仪测定峰面积，将测得的峰面积积分值代入273项回归方程计算待测样品中绿原酸含量。

28截留率和转移率计算

分别精密吸取纳滤（或减压浓缩）分离过程中产生的原液、平衡液、纳滤（或浓缩）液，按上述相关项下的检测条件，计算待测组分的质量浓度。

R=（1-C1C2）×100%（1）

D=C3·VC0·V0×100%（2）

式中，R为截留率，D为转移率，C0为原液中绿原酸浓度，C1为纳滤液中绿原酸浓度，C2为平衡液中绿原酸浓度，C3为减压浓缩液中绿原酸浓度，V0为原液体积，V为减压浓缩液体积。

3结果

31pH对绿原酸纳滤分离的影响

绿原酸截留率曲线见图1，在10%乙醇环境中，随着溶液pH升高其截留率呈现出随之增加的趋势，其中在pH 3～7升高趋势明显，因此在响应曲面法参数优选中着重进行考察。绿原酸截留率的变化是由于其存在状态从游离态逐步向离子态转变，根据纳滤膜分离的道南效应[89]，从而引起截留率升高。而在pH 2～4绿原酸截留率偏低，是由于游离态存在的绿原酸在含有有机溶剂的溶液环境中的纳滤溶解扩散系数增加[1011]，促进绿原酸通过纳滤膜，引起截留率下降，从而提示pH与有机试剂在纳滤分离时存在交互作用。

32乙醇浓度对绿原酸纳滤分离的影响

不同pH条件下绿原酸截留率曲线见图2，乙醇浓度对绿原酸截留率的影响不尽相同。当pH 3时，随着乙醇浓度的增加，绿原酸截留率呈现出下降趋势；当pH升高至5以上时，随着乙醇浓度的增加，绿原酸截留率呈现则明显升高。说明绿原酸存在状态决定了其纳滤分离行为，当以游离态形式存在时，乙醇浓度增加提升了其膜面溶解扩散系数[12]，而随着游离态向解离态的转化，增强了绿原酸与膜面的道南效应，导致解离态绿原酸难以进入纳滤膜表面，且此效应与乙醇浓度呈现出一定正相关。当pH为7时，绿原酸在水溶液条件下的截留率接近90%，虽然具有较高的截留率，但为保证绿原酸稳定性，操作条件倾向于酸性溶液环境。基于膜截留相对分子质量、溶液pH、乙醇浓度对绿原酸截留行为的交互影响，选择响应面法对绿原酸的分离行为及浓缩参数进行优化研究。

33响应面法分析优化纳滤分离参数

根据BoxBenhnken中心组合设计原理，根据单因素试验结果，根据前期的实验结果，在排除溶质与膜面吸附的前提下，操作方法为：溶液温度20 ℃、操作压力10 MPa条件下，每组试验平行操作3次，截留率取平均值。选取截留相对分子质量、乙醇浓度、pH 3个因素，在单因素试验的基础上采用三因素三水平的响应面分析方法，研究三因素不同组合对绿原酸截留率的影响。试验设计及结果见表2，方差分析见表3。

331模型方程建立与显著性检验利用DesignExpert 806软件对试验结果进行回归拟合，得到绿原酸截留率对截留相对分子质量、乙醇浓度、pH 3个因素的二次多项回归模型：绿原酸截留率Y=8346-1164 A+597B+2154C+350AB+1181AC-290 BC-071 A2+025 B2+10944 C2。回归F为11259，在所考察的试验范围内，3个因素对绿原酸截留率影响的排序为C>A>B。多元相关系数R2=0993 1，预测R2=0937 4，调整R2=0984 3，说明模型对试验实际情况拟合较好；P<0000 1说明该模型高度显著，可用来进行响应值的预测，试验设计方案正确。

332响应曲面分析及条件优化多元回归方程式所做的响应曲面图，见图3。由此可对两因素交互影响绿原酸截留率进行分析与评价，以确定最佳因素水平范围。可以看出，所考察因素对绿原酸截留率均有不同程度的影响，其中溶液pH影响显著，随着溶液环境由酸到碱，绿原酸逐步离子化成盐，根据纳滤膜分离的电荷效应，以离子形式存在的绿原酸与荷负电的纳滤膜之间的道南效应要强于游离态，从而引起成分截留率升高。纳滤膜的截留相对分子质量的影响显著，随着截留相对分子质量减小，绿原酸截留率随之增大；乙醇浓度对绿原酸截留率影响显著，曲面斜率大，随着乙醇浓度的升高，以游离态形式存在的绿原酸成分扩散系数增加，从而出现截留率下降的现象，而以解离态存在的绿原酸根据溶解扩散模型，由于在膜面的溶解度较低，截留率上升。

绿原酸截留率数据中A，B，C 3因素之间存在一定的交互作用，纳滤膜截留相对分子质量和pH对绿原酸截留率影响交互作用显著，随着pH的升高或截留相对分子质量的降低，绿原酸截留率呈现上升趋势；同理，纳滤膜截留相对分子质量和乙醇浓度对绿原酸截留率影响交互作用较显著，在pH 5条件下，随着乙醇浓度升高或截留相对分子质量降低，绿原酸截留率呈现上升趋势；溶液pH与乙醇浓度也表现出一定的交互作用，这主要是绿原酸存在状态所引起的，在pH 3时，随着乙醇浓度的增加，绿原酸截留率下降，而pH 7时，随着乙醇浓度的增加，绿原酸截留率则明显升高。

34纳滤富集参数优化及减压浓缩对比分析

由DesignExpert软件优化分析，以提高绿原酸截留率和膜分离效率、保障绿原酸等酚酸类成分的稳定性[13]为目的，得到绿原酸的最佳纳滤富集工艺为：截留相对分子质量450，乙醇浓度1637%，pH 613，理论计算绿原酸截留率为9500%。为了验证回归模型的有效性，根据拟合的最佳工艺参数和试剂操作的可行性，调整乙醇浓度1600%、pH 60，截留相对分子质量450条件下进行验证性实验并与减压浓缩工艺进行对比，结果见表4。在绿原酸保留方面，纳滤高于传统的减压浓缩，且由于乙醇含量较低，减压浓缩效率低下。在对比试验开展过程中发现纳滤富集周期不足减压浓缩的10%，富集效率及技术优势明显。

4讨论

中药分离精制过程中，含有低浓度有机试剂的中间体在溶剂回收时存在效率低下、成分损失严重的技术难题。纳滤分离主要用于水溶液环境的富集纯化，对于低浓度有机试剂的回收尚处于空白应用阶段，以低浓度乙醇中绿原酸的富集为例发现，绿原酸存在状态决定了其分离行为，说明对于低浓度有机溶剂的纳滤分离主要遵循道南效应和溶解扩散理论[14]。酸性条件下的绿原酸主要以游离态形式存在，随着乙醇浓度的增加，绿原酸更易吸附溶解在膜表面，从而促进其透过。解离态形式存在的绿原酸一方面由于道南效应产生的电荷排斥不易进入膜表面，随着乙醇浓度的增加，其在膜面的吸附溶解行为进一步减弱，所以在2种效应的综合作用下，绿原酸截留率显著升高。

膜分离技术具有分离参数易控、分离行为重现性、参数可线性放大等技术优势，在对低浓度乙醇纳滤分离时，需要注意纳滤液中乙醇浓度的变化以及乙醇对纳滤膜的溶胀损伤。在纳滤处理含有低浓度乙醇溶剂时，进料液与纳滤液中乙醇浓度未出现明显变化，提示在传统的精制分离产生的含低浓度有机试剂水溶液，可通过纳滤分离技术处理，在去除溶質成分的同时不改变溶剂比例，可提升生产分离效率。同时，在低浓度乙醇的浸泡下，纳滤膜通量出现下降趋势，说明膜材质发生溶胀，纳滤膜孔径缩小，降低了膜通量提升了截留效率，但未对膜完整性产生明显影响。

采用响应面分析法中的BoxBehnken模式，对纳滤浓缩参数进行优化筛选，数学模型拟合程度高，实验误差小，且优于传统的减压浓缩工艺，可用于实际生产预测。得到优化工艺条件为：截留相对分子质量450，乙醇浓度1600%，pH 600，在此条件下绿原酸截留率为9260%，通过对低浓度乙醇的纳滤分离，不仅为中药成分精制纯化提供技术支撑，而且对于中药资源的合理化利用及其制药废水处理带来新的机遇。

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[责任编辑孔晶晶]