牛支原体快速PCR检测方法的建立及其应用

徐引弟，李海利，王治方，张青娴，索延乐，宋振宇

（1.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，郑州 450002；2.河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，郑州 450002；3.济源市动物卫生监督所，济源 459000）

牛支原体快速PCR检测方法的建立及其应用

徐引弟1,2，李海利1,2，王治方1,2，张青娴1,2，索延乐3，宋振宇3

（1.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，郑州 450002；2.河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，郑州 450002；3.济源市动物卫生监督所，济源 459000）

本试验旨在建立一种可直接从病料中快速检测牛支原体的PCR方法，并且应用于临床。根据牛支原体16S rRNA 基因设计一对引物，配制PCR扩增体系，样品经简单处理后加入体系进行扩增，最终扩增出1 390bp片段，进一步的试验证明该方法具有良好的特异性和敏感性。临床样品检测结果显示，该方法的检出率与传统PCR的符合率为100%。试验表明，该方法能快速直接从临床样品中检测出牛支原体，可用于牛支原体的大量临床样品的检测。

快速直接PCR；牛支原体；特异性；敏感性；临床应用

牛支原体.(Mycoplasma.bovis).主要引起牛的肺炎、关节炎、乳房炎、角膜结膜炎、生殖道炎症以及流产和不孕等疾病。1961年，.美国人Hale等首次从患乳房炎奶牛的牛奶中分离出牛支原体。1976.年牛支原体被描述为致呼吸道疾病的主要病因，之后，牛支原体及其相关疾病迅速扩散至世界各个国家和地区的牛群，对世界养牛业的健康发展造成了极大的威胁和严重的经济损失[1～3]。2008年以来，我国多地相继发生并广泛流行以发热、咳嗽和流鼻涕为主要症状、以坏死性肺炎为主要病变的牛呼吸道传染病，后被确定为牛支原体感染所致的牛支原体肺炎。由于该病的常规药物疗效不佳，且无有效疫苗进行预防，因此给我国的养牛业造成了严重经济损失[4～6]。

由于牛支原体病的临床症状无特殊性，在临床上极易与其他疾病相混淆，因此，目前牛支原体的诊断主要靠实验室诊断。实验室诊断方法主要有病原学诊断、免疫学诊断、分子生物学诊断等。其中，病原学诊断最为确实，但耗时较长；血清学方法诊断的灵敏度低，非特异性高[7～10]。

因此，建立快速、灵敏和特异的牛支原体检测方法，对牛支原体引起的疾病进行及时、准确诊断和有效控制，具有重要意义。本试验建立了直接从病料中扩增牛支原体的方法，该方法简单、快速、特异、敏感，可以用于临床样品的检测。

1 材料与方法

1.1 病料

病料采自河南省发生呼吸道疾病、子宫内膜炎、乳房炎、流产等疾病的患牛，包括肺、淋巴结、子宫积液、牛奶和鼻咽拭子。阳性对照为牛支原体HB0801株，由华中农业大学郭爱珍教授惠赠。

1.2 主要试剂

2×Direct.PCR.Mix、Hot.Start.Taq酶、Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒，购自生工生物工程（上海）有限公司。

1.3 引物的设计

根据GenBank中牛支原体16S.rRNA基因设计一对引物，由上海生物工程有限公司合成，引物序列：上游引物P1：5’-CCTTAGGCAGTTTCTTTATAA-3’，下游引物P2：5’-CATGCATGTCGAGCGATGAT-3’，预计扩增的目的片段为1390bp。

1.4 直接PCR方法的建立

1.4.1.样品的采集

固体病料采集：无菌条件下采集肺、淋巴结10～100mg，装入无RNA酶污染的离心管中备用；液体病料采集：直接采集子宫积液、牛奶用于试验。鼻咽拭子采集鼻咽液后，装入无RNA酶污染的离心管中备用。

1.4.2.样品处理

鼻咽拭子中加入200µL灭菌ddH2O，挤压后弃掉拭子。固体状病料样品取2mg，研磨后加入20µL灭菌ddH2O，震荡混匀，快速涡旋数秒，取1µL上清作为模板。

1.4.3.直接PCR

20µL反应体系样品：上清1µL，2×Direct.PCR. Mix.10µL，10.pM.P1.1µL，10.pM.P2.1µL，5U/µL. Hot.Strart.Taq酶0.5µL，加灭菌ddH2O至20µL，充分混匀，阳性对照和阴性对照分别取1µL加入19µL. PCR扩增试剂；PCR扩增程序：98℃.30s，35个循环（98℃.5s、55℃.5s、72℃.5s），最后72℃.1min；取5µL扩增产物电泳。

1.5 特异性试验

将已分离鉴定的猪链球菌、副猪嗜血杆菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、波氏杆菌、沙门氏菌培养，取单菌落溶于20µLddH2O，取1µL加入直接PCR反应体系扩增。

1.6 灵敏性试验

样品处理后，取1µL上清作为模板，依次10倍稀释至10-5，各取1µL作为模板进行直接PCR扩增，确定其敏感性。

1.7 临床应用

从发生临床典型症状的病牛采集鼻拭子57份，按照试剂盒说明进行操作，直接PCR后进行电泳检测，结果显示阳性32份，同时，提取样品DNA进行常规PCR检测，分析比较两种方法的检测结果。

2 结果与分析

2.1 直接PCR方法的建立

样品经过简单处理，加入直接PCR扩增体系，扩增出约为1.390bp的片段，符合预期大小，阳性对照也扩增出1.390bp条带，阴性对照没有条带（如图1）。将阳性样品PCR扩增产物测序，通过比对，与牛支原体HB0801-P180株（Genbank.no.CP007591）同源性为100%。

图1 直接PCR扩增的结果

2.2 特异性试验

将几种病原菌用同样方法进行扩增，结果均未扩增出条带，只有含牛支原体的阳性病料扩增出特异性条带（图2），证实该方法有较好的特异性。

图2 特异性检测结果

2.3 灵敏性试验

将模板进行10倍稀释扩增（如图3），模板稀释度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5时，均能扩增出清晰条带，证明该方法检测的敏感度为10-4，敏感性好。

图3 敏感性检测结果

2.4 临床应用

检测临床样品57份，直接PCR法检出阳性32份，与常规PCR结果一致（如图4），与常规PCR符合率为100%，证实本方法适合临床样品的快速检测。

图4 PCR的临床应用检测结果

3 讨论

牛支原体PCR检测方法具有较好的敏感性和特异性，是临床病原学诊断中较为普遍的一种方法。但是传统的PCR检测方法需要样品裂解、DNA提取、PCR扩增、电泳检测等步骤，需时5h以上，从支原体临床分离培养到纯化及DNA提取扩增至少需要3～4d才能做出初步鉴定。传统的PCR和分离鉴定不仅费时费力，而且敏感性差，容易产生假阳性的结果，不利于养殖户和规模化企业快速、准确、及时地诊断病原及采取相应的应对措施[7～10]。

本试验针对现有技术存在的缺陷，建立了一种快速的直接检测牛支原体的PCR方法，样品经简单处理后，可直接扩增，快速反应，整个过程在1h内就可完成，检测迅速，特性异强，灵敏性佳。从临床应用情况看，该方法能快速、准确地检测出牛支原体。

牛支原体在河南省发病牛场中发病率较高，在呼吸道疾病、子宫内膜炎病例中阳性率很高，同时又与其他病原混合感染且耐药性强，这与之前其他报道的高发病率是相符的[11～15]。应用本试验的方法，可对牛支原体感染的单个样品检测，也可对临床病例中的混合感染进行检测，可用于牛支原体普查、分子流行病学调查及疫苗筛选和监测。

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Development and Application of Rapid and Direct PCR Method of Mycoplasma Bovis

XU Yin-di1,2, LI Hai-li1,2, WANG Zhi-fang1,2, ZHANG Qing-xian1,2, SUO Yan-le3, SONG Zhen-yu3
(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Research, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002; 2.Henan Key Laboratory of Farm Animal Breeding and Nutritional Regulation, Zhengzhou 450002; 3.Animal Health Inspection in Jiyuan City Henan Province, Jiyuan 459000)

The aim of this study was to develop a rapid and direct PCR method to detect Mycoplasma bovis from diseased materials. A pair of primers were designed according to the sequence of 16S rRNA gene of Mycoplasma bovis, and the system of direct PCR amplification was prepared. After simple treatment, the samples were added into the system for amplification and electrophoresis. A 1390 bp fragment was amplified, and the specificity and sensitivity were tested. The results showed that the method was specific and sensitive. The method was applied to detect clinical samples, and the detection rate was 100% conform with the traditional PCR. The method can directly detect Mycoplasma bovis from clinical samples and can be used for the detection of a large number of clinical samples of Mycoplasma bovis.

Rapid and direct PCR method; Mycoplasma bovis; Specificity; Susceptibility; Clinical application

S858.23

A

1004-4264（2017）06-0041-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.06.010

2017-03-18

河南省科技攻关计划项目（162102110042）；河南省农业科学院自主创新基金项目（2016ZC51，2017ZC49）。

徐引弟（1974-），女，湖北浠水人，副研究员，博士，主要从事动物病原微生物研究。