谷子Aux/IAA家族基因干旱胁迫响应表达模式分析

刘晶，王俊杰，程璐，陈利青，禾璐，候蕊，韩渊怀,*

(1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801； 2.山西农业大学 生物工程研究所，山西 太谷 030801；3.山西省农业科学院玉米研究所，山西 忻州 034000； 4.山西省晋城市城区农业委员会，山西 晋城 048400)



谷子Aux/IAA家族基因干旱胁迫响应表达模式分析

刘晶1，王俊杰2，程璐1，陈利青1，禾璐3，候蕊4，韩渊怀1,2*

(1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801； 2.山西农业大学 生物工程研究所，山西 太谷 030801；3.山西省农业科学院玉米研究所，山西 忻州 034000； 4.山西省晋城市城区农业委员会，山西 晋城 048400)

[目的]Aux/IAA是重要的蛋白质转录因子，广泛参与植物生长素介导的应答作用，同时参与植物的胁迫和防御响应。本文通过分析Aux/IAA家族基因在干旱胁迫中的表达情况，探索谷子抗旱与Aux/IAA家族基因的关系。[方法]本文对谷子Aux/IAA家族基因理化性质、蛋白亲疏水性、启动子功能元件等进行生物信息学分析，并对抗旱(GG)和干旱敏感(JF16)谷子品种在浇水和干旱胁迫下基因的表达谱数据进行分析。[结果]谷子Aux/IAA家族基因均含有多个与胁迫相关的功能元件，且5个基因编码的蛋白均为亲水性蛋白；干旱胁迫处理后，GG和JF16中5个基因的表达变化趋势有所不同，Seita.5G126200、Seita.1G028400、Seita.3G109400表达量均下调，Seita.1G356800基因的表达量明显上调。[结论]谷子Aux/IAA家族基因参与调控谷子干旱胁迫，其调控过程比较复杂，可作为参与谷子抗旱的候选基因。本研究结果为进一步探究谷子中Aux/IAA与抗旱机制提供一定理论依据。

谷子；Aux/IAA； 干旱胁迫； 生物信息学分析

谷子(Setariaitalica(L.)Beauv.)，在古代被称做“百谷之长”，是我国种植最古老的农作物之一，是重要的杂粮作物[1]。我国的谷子种植范围较广，主要分布在华北、东北地区。由于种植地区不同，各地区的环境、气候条件差异较大，对谷子的生长发育产生较大影响。

目前，影响谷子产量的众多因素中，干旱(drought)是限制谷子产量提高的主要因素。因此，了解谷子干旱胁迫条件下的分子机制对提高谷子抗旱性有很大作用。

生长素IAA(Indole-3-acetic acid)是重要的植物激素之一，对植物生长发育具有重要的调节作用，其在转录水平上的调控受很多蛋白的影响。Aux/IAA(auxin /indoleacetic acids protein)和生长素应答因子ARF(auxin response factor)是2个重要的蛋白质转录因子，它们广泛参与植物生长素介导的应答作用， Aux/IAA蛋白是通过与ARF转录因子相互作用介导生长素反应的短寿命转录调控因子。通常Aux/IAA家族基因均包含4个保守结构域：结构域 I、II、III、IV[2]。

近年来对Aux/IAA基因家族的研究逐渐成为热点，虽然对植物生长素的研究主要集中在植物发育过程中，但最近的一些研究表明，生长素也参与植物的胁迫或防御反应。据报道，植物感病时内源性激素IAA含量显著增加[3]，同时，一些生长素调节基因的表达量也会发生改变[4]；microRNA介导的生长素信号被抑制时，可以使细菌的耐药性增强[5]；对水稻生长素相关的基因进行全基因组分析发现，几种与生长素相关的基因在各种非生物胁迫条件下的表达存在差异，说明生长素与非生物胁迫信号之间有联系[6]；拟南芥处于低温环境时，其中Aux/IAA和ARF基因家族成员的表达也会发生改变[7]。

目前国内外对于谷子中Aux/IAA基因家族干旱胁迫表达分析的研究较少，本研究以耐旱品种勾勾母鸡咀(GG)和干旱敏感品种晋汾16(JF16)为材料，种植21 d后，用20%的PEG-6000对谷子幼苗采取干旱胁迫处理，将处理后的幼苗提取RNA，进行表达谱测序分析，找到与胁迫相关的Aux/IAA家族基因，对其理化性质、启动子元件等进行生物信息学分析，同时对干旱胁迫下耐旱品种GG和干旱敏感品种JF16中不同Aux/IAA家族基因成员的表达量进行分析，为进一步研究谷子Aux/IAA家族基因在干旱胁迫过程中的功能奠定基础，为阐明谷子在分子水平的抗旱机制提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用材料耐旱品种勾勾母鸡咀(GG)和干旱敏感品种晋汾16(JF16)，由山西农业大学农业生物工程研究所和山西省农业科学院品种资源研究所提供，在山西农业大学农学院人工气候室种植培养。

将GG和JF16种于混合土壤(蛭石∶营养土=1∶3)，在14 h光照(28 ℃)、10 h黑暗(23 ℃)条件下培养21 d后，用20%的PEG-6000对谷子幼苗进行30 min干旱胁迫处理，对照组用蒸馏水处理。将处理后的幼苗随机选取3株，提取RNA、反转录，然后进行表达谱测序分析。

1.2 试验方法

利用ExPASY(https://web.expasy.org/compute-pi/)分析谷子Aux/IAA家族基因的理化性质；

利用GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析基因结构；

利用Expasy Protscale(http://web.expasy.org/protscale/)分析Aux/IAA家族基因编码蛋白的亲水/疏水性；

利用Phytozome 12(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)谷子基因组数据库查找Aux/IAA家族基因的基因序列信息；

利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对谷子Aux/IAA家族基因进行启动子元件分析；

利用MAGA7.0软件对谷子中找到的5个Aux/IAA家族基因与玉米、高梁等禾本科作物的Aux/IAA基因进行比对，构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 谷子Aux/IAA家族基因的基因结构与理化性质

在谷子中找到了5个Aux/IAA家族基因，对它们进行基因结构和理化性质的分析，主要包括基因组序列长度、CDS序列长度、在染色体上的位置、氨基酸数量、等电点和分子量。由表1可见，谷子Aux/IAA家族的5个基因分布在3条不同的染色体上，分别位于1，3，5号染色体的不同位点。他们的基因组序列长度有很大区别，最小为973 bp，最大的有4 822 bp；有4个蛋白长度在231～277个氨基酸之间，最小(Seita.1G028400)为175个氨基酸，相对应的蛋白分子量在18 914.19(Seita.1G356800)～29 316.79(Seita.1G028400)Da之间，CDS序列长度在528～834 bp之间。等电点分析发现，除Seita.1G356800等电点的为6.08显酸性外，其余4个均大于7.5，显碱性。

表1 谷子Aux/IAA 家族基因的基本信息

2.2Aux/IAA家族基因内含子-外显子结构组成分析

使用GSDS2.0对Aux/IAA家族基因的CDS序列、基因序列进行结构分析。由图1可见所有基因都包含内含子和外显子结构，Seita.1G028400、Seita.3G109400都含有5个内含子，Seita.5G268600含有4个内含子，而Seita.1G356800和Seita.5G126200只含有2个内含子；Seita.5G126200不含有上下游序列，Seita.1G028400、Seita.3G109400有较长的上游序列。

图1 谷子Aux/IAA 家族基因内含子-外显子结构Fig.1 Intron-exon structures of Aux/IAA family members in foxtail millet

2.3Aux/IAA家族基因编码蛋白的亲水/疏水性分析

用Expasy Protscale分析Aux/IAA家族基因编码蛋白的亲水/疏水性，结果如图2所示，Aux/IAA家族基因蛋白氨基酸残基中疏水性最强的为Seita.1G356800(2.500)，最弱的为Seita.3G109400(2.360)；亲水性最强的为Seita.5G126200(-3.780)，最弱的为Seita.3G109400(-3.080)。在5个Aux/IAA家族基因编码的蛋白中，亲水性氨基酸数量明显多于疏水性氨基酸的数目，故推断5个Aux/IAA家族基因编码的蛋白均为亲水蛋白。

2.4Aux/IAA家族基因的启动子元件及功能分析

使用在线软件PlantCARE对所取谷子的Aux/IAA家族基因启动子上游1 500 bp进行启动子元件分析。由表2可见，谷子Aux/IAA家族基因都含有至少一个或多个与胁迫相关的调控元件，它们共同调控谷子生长过程对胁迫的应对。5个基因均含有与茉莉酸甲酯(MeJA)相关的调控元件，除Seita.5G126200外均含有与脱落酸(ABA)相关的调控元件，除Seita.1G356800外都含有与水杨酸(SA)相关的调控元件，Seita.1G356800和Seita.1G028400含有与赤霉素(GA)相关的调控元件等。

图2 Aux/IAA家族基因蛋白的亲水/疏水性预测Fig.2 Prediction of hydrophobicity and rophilicity of Aux/IAA family members

2.5Aux/IAA家族基因成员干旱胁迫时在GG和JF中的表达量分析

使用20%的PEG-6000对谷子幼苗进行干旱胁迫处理后，对Aux/IAA家族基因在耐旱品种GG和干旱敏感品种JF16中的表达量进行分析。

由图3可见，GG和JF16中，Seita.5G126200、Seita.1G028400、Seita.3G109400三个基因在干旱胁迫条件下，表达量都下调；Seita.5G268600基因在正常浇水时，2个品种相比表达水平差异不明显，在干旱胁迫时，耐旱品种GG中表达量上调，在干旱敏感品种JF16中表达量却出现下调；Seita.1G356800基因在正常浇水情况下，在GG中表达水平很低，在JF16中表达水平较高；在干旱胁迫时，GG和JF16中Seita.1G356800基因的表达量都明显上调。

表2 谷子Aux/IAA家族基因启动子功能元件数目

图3 谷子Aux/IAA家族基因干旱胁迫及对照情况下在GG和JF中的表达量Fig.3 The expression of Aux/IAA family members in GG and JF under drought stress and control

2.6 谷子Aux/IAA家族基因系统进化树

使用MAGA7.0软件对谷子中找到的5个Aux/IAA家族基因与玉米、高梁等禾本科作物的Aux/IAA基因进行比对，构建系统进化树，可以直观的看到5个成员与玉其他植物Aux/IAA基因亲缘关系的远近，了解其进化过程。由图4可见，Aux/IAA家族5个基因中，Seita.5G268600与Zeamays5亲缘关系最近，Seita.5G126200与Zeamays15处在同一分支上，亲缘关系较近，而Seita.1G356800与Zeamays9亲缘关系较近，且Seita.5G268600、Seita.5G126200、Seita.1G356800处在同一大的分支，表明这3个基因亲缘关系较近。Seita.1G028400与Seita.3G109400处在一个大的分支，分别与Zeamays2和Zeamays16聚为一类，说明二者亲缘关系较其他3个基因近。

图4 谷子Aux/IAA家族基因进化树分析Fig.4 Phylogenetic tree of Aux/IAA family members

3 结论与讨论

生长素IAA是植物体内一种非常重要的激素，在植物的生长发育过程中起重要的调节作用。Aux/IAA基因是生长素信号转导过程中重要的调节转录因子，同时它在植物抗逆性方面也起到调节作用。本试验通过对谷子幼苗进行20%的PEG-6000干旱胁迫处理，找到5个响应干旱胁迫的Aux/IAA家族基因，对其基因结构、理化性质、与胁迫相关的启动子原件等进行分析，为研究谷子Aux/IAA家族基因在干旱胁迫等发育进程中的功能奠定基础。

通过对Aux/IAA家族5个基因编码的蛋白质进行亲水/疏水性分析，发现5个蛋白均为亲水性蛋白。蛋白质的高亲水性使植物即使受到干旱胁迫，蛋白质也能够代替细胞中的水分子，从而很好的抵御干旱胁迫对植物造成的损伤，在提高植物的抗逆性方面有很大作用[8]。表明，Aux/IAA家族基因对谷子抗旱性的提高方面有影响。

通过对谷子Aux/IAA家族基因启动子上游1 500 bp进行启动子元件分析，结果显示，谷子Aux/IAA家族基因包含许多与胁迫相关的元件：ABRE是与脱落酸(ABA)相关的调控元件，而ABA可以提高植物的抗旱能力；CGTCA-motif和TGACG-motif均是与茉莉酸甲酯(MeJA)相关的调控元件，MeJA能够激发植物防御基因的表达，从而提高植物的抗逆能力[9]；TCA-element和TATC-box分别是与水杨酸(SA)和赤霉素(GA)相关的调控元件，据报道，干旱条件下在玉米幼苗叶表皮喷洒SA可以提高其抗旱性、GA可以提高烟草幼苗及种子的抗旱性[10,11]；MBS(TAACTG)是与干旱诱导相关的调控元件；MBS(CGGTCA)、TC-rich repeats等都是与胁迫相关的调控元件，它们共同作用来调节谷子生长过程对胁迫的响应。

有研究表明，对不同胁迫下水稻中Aux/IAA家族基因的表达谱进行分析，多个基因表达量出现上调或下调[12]。本试验通过分析Aux/IAA家族的5个基因在耐旱品种GG和干旱敏感品种JF16中的表达量，发现在干旱胁迫时，Seita.1G356800基因表达量在2个品种中都上调，说明该基因响应干旱胁迫，提高植物的抗旱能力，与Jain等人的研究结果一致[6]；Seita.5G268600基因干旱胁迫下在耐旱品种GG中表达量上调，在干旱敏感品种JF中表达量下调，说明该基因在2个不同品种中表达响应不同，可能是造成2个品种抗旱能力不同的原因之一；Seita.5G126200、Seita.1G028400、Seita.3G109400三个基因表达量均下调，说明Aux/IAA家族基因在生长素、水杨酸和抗生素胁迫信号通路之间的串扰中起到重要作用[13]。

综上所述，本文对谷子Aux/IAA家族基因的理化性质、蛋白质亲疏水性、所含胁迫相关元件以及系统进化树进行了生物信息学分析，基于不同品种谷子干旱胁迫下的表达谱数据，初步探究了谷子Aux/IAA家族基因在干旱胁迫下的表达量及变化规律，为研究谷子抗旱分子机制提供了一定的理论依据。

[1]禾璐．绿色小米品种大青谷米色形成机制研究[D]．太谷：山西农业大学，2015．

[2]Hagen G，Guilfoyle T．Auxin-responsive gene expression: genes,promoters and regulatory factors[J]．Plant Molecular Biology，2002，49(3 /4)：373-385.

[3]O’Donnell P J，Schmelz E A，Moussatche P，etal．Susceptible to intolerance a range of hormonal actions in a susceptible Arabidopsis pathogen response[J]．Plant Journal，2003，33(2)：245-257．

[4]Dowd C，Wilson I W，McFadden H．Gene expression profile changes in cotton root and hypocotyl tissues in response to infection with Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum[J]．Molecular Plant-Microbe Interactions，2004，17(6)：654-667．

[5]Navarro L，Dunoyer P，Jay F，et al．A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling[J]．Science，2006，312(5772)：436-439．

[6]Jain M，Khurana J P．Transcript profiling reveals diverse roles of auxin-responsive genes during reproductive development and abiotic stress in rice[J]．Febs Journal，2009，276(11)：3148-3162．

[7]Hannah M A，Heyer A G，Hincha D K．A global survey of gene regulation during cold acclimation in Arabidopsis thaliana[J]．Plos Genetics，2005，1(2)：e26．

[8]Baker J，Steele C，Dure L．Sequence and characterization of 6 Lea proteins and their genes from cotton[J]．Plant Molecular Biology，1988，11(3)：277-291．

[9]Horbowicz M，Kosson R，Wiczkowski W，et al．The effect of methyl jasmonate on accumulation of 2-phenylethylamine and putrescine in seedlings of common buckwheat (Fagopyrum esculentum)[J]．Acta Physiol Plantarum，2011，33(3)：897-903．

[10]坎平，王莎莎，马文广，等. 赤霉素引发同时提高烟草种子及幼苗抗旱性和抗冷性[J]. 种子，2014，33(2)：30-34，38．

[11]曹翠玲，刘林丽，田强兵．水杨酸对玉米幼苗抗旱性的影响[J]．玉米科学，2004，12(增刊)：103-104．

[12]Song Y，Wang L，Xiong L．Comprehensive expression profiling analysis of OsIAAgene family in developmental processes and in response to phytohormone and stress treatments[J]．Planta，2009，229(3)：577-591．

[13]Cakir B，Kilickaya O，Olcay A C．Genome-wide analysis ofAux/IAAgenes in Vitis vinifera: cloning and expression profiling of a grapeAux/IAAgene in response to phytohormone and abiotic stresses[J]．Acta Physiologiae Plantarum，2013，35(2)：365-377．

(编辑：韩志强)

Expression analysis ofAux/IAAfamily members in response to drought stress in foxtail millet

Liu Jing1, Wang Junjie2, Cheng Lu1, Chen Liqing1, He Lu3, Hou Rui4, Han Yuanhuai1,2*

(1.CollegeofAgriculture，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China; 2.InstituteofAgriculturalBioengineering，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China; 3.MaizeResearchInstitutetoShanxiAcademyofAgricultureSciences，Xinzhou034000，China; 4.UrbanAgricultureCommitteeofShanxiJincheng，Jincheng048400，China)

[Objective]Aux/IAA is an important transcription factor protein. It is widely involved in plant auxin-mediated response, plant stress and defense response. The relationship between drought resistance andAux/IAAfamily members was studied by analyzing the expression ofAux/IAAfamily members under drought stress in foxtail millet.[Methods]The bioinformatics analysis was carried out on the physicochemical properties, protein hydrophobicity and cis-acting elements of theAux/IAAfamily members in foxtail millet. Then we analyzed the expression ofAux/IAAfamily members under drought stress.[Results]The result showed that there were a number of stress-related functional elements in theAux/IAAfamily members in foxtail millet, and the proteins they code were all hydrophilic. The expression levels of genes were significantly different between drought-tolerant and drought-sensitive varieties under drought stress. The expression levels ofSeita1.5G126200,Seita.1G028400 andSeita.3G109400 were down-regulated, whereas the expression level ofSeita.1G356800 gene was significantly up-regulated.[Conclusion]TheAux/IAAfamily members in foxtail millet are involved in the regulation of millet drought stress, and the process of regulation is a complex process. Some of them could also be used as candidate genes for drought tolerance in foxtail millet. Theseresult provide a theoretical basis for further study of the mechanism of the relationship between theAux/IAAand drought tolerance in foxtail millet.

Foxtail millet,Aux/IAAfamily members, Drought stress, Bioinformatics analysis

2017-04-21

2017-05-22

刘晶(1994-)，女(汉)，山西晋中人，硕士，研究方向：基因组学与分子育种

*通信作者：韩渊怀，教授，博士生导师，Tel：0354-6287239；E-mail：swgctd@163.com

国家自然科学基金(31401396)；山西农业大学科技创新基金(20142-07)

S515

A

1671-8151(2017)09-0609-07