直投式发酵辣椒复合菌剂的制备

沈畅萱 王修俊 朱隆绘 黄 珊

(1. 贵州大学发酵工程与生物制药省级重点实验室，贵州 贵阳 550025；2. 贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025)



直投式发酵辣椒复合菌剂的制备

沈畅萱 王修俊 朱隆绘 黄 珊

刘佳慧LIUJia-hui尹 爽YINShuang田 多TIANDuo

(1. 贵州大学发酵工程与生物制药省级重点实验室，贵州 贵阳 550025；2. 贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025)

为开发发酵辣椒复合菌剂，提高发酵辣椒工业生产效率，对从自然发酵辣椒中筛选鉴定出的菌株进行产酸能力、耐酸性、耐盐性和安全性等发酵能力测定，选择出发酵菌剂的备选菌株为植物乳杆菌、乳酸乳球菌和枯草芽孢杆菌。通过接种配比试验和对发酵条件的优化，得出复合菌剂的最佳配方：菌液(枯草芽孢杆菌∶乳酸乳球菌∶植物乳杆菌)体积比为1∶4∶1，接种量6%，发酵时间66 h，盐浓度4%。该条件下得出的发酵辣椒产酸量为0.77%；感官评定分数17.525。

发酵辣椒；直投式；复合菌剂；发酵能力

自然发酵辣椒是中国传统调味品。但由于自然菌群情况随机多变，故其品质不易控制，安全性不稳定，且传统发酵辣椒，多采用高盐分腌制，使得发酵辣椒制品在色、香、味等各方面的感官大打折扣且不利于健康。目前发酵辣椒产业因工业化水平较低，存在发酵过程难以控制、受自然条件影响较大等劣势，使得产品质量较低，难以大规模生产。

当前，中国对于发酵食品菌剂的研究多为单一菌剂的开发，王雪雅等[4]通过对10株乳酸菌进行产酸性、抑菌性等性能的筛选，选出产酸量为0.020 8 g/100 g的发酵乳杆菌和产酸量为0.020 3 g/100 g的食果糖乳杆菌；卢翰等[5]以纯菌种发酵为基础，探究出辣椒酱最适发酵工艺，发酵时间6 d，发酵结束后含酸量0.59%；崔小利等[6]对市售鲊辣椒中微生物进行分离、鉴定，并对得到的菌种产酸性等性能以及发酵成品的感官进行鉴定，得出鲊辣椒自然发酵过程中的主发酵菌是乳酸菌，纯种发酵的适合菌种是植物乳杆菌；王微等[7]用纯种发酵得到鲊辣椒的发酵时间为4 d。以上研究所得到的产品生产时间相对过长，在发酵过程中有很多不可控因素，发酵时间越长，其对产品品质影响越大。因此，缩短发酵时间有助于提高发酵辣椒的品质。关于快速发酵的研究，孟宪刚等[8]对西北酸菜高效复合发酵菌种进行筛选，选出分别具有产酸速度最快、醇香味适中、降解亚硝酸和发酵风味接受度最高的4种菌株，但未对复合后的菌剂进行鉴定；卫玲玲等[9]研究了用于发酵甘蓝的微生物复配，配方为短乳杆菌与植物乳杆菌按1∶1复配，总接种量为2%～3%，发酵效果最好；张良等[10]对四川泡菜乳酸发酵菌剂进行研究，以四川老泡菜水为原料，分离、鉴定、筛选菌种，比较发酵剂发酵与传统家庭泡菜的差异，针对叶菜类泡菜、茄果类泡菜和块茎类泡菜研制不同的发酵菌剂配方。

本试验拟以贵州遵义地区所产辣椒为原料，对自然发酵辣椒中筛选出的多个优势菌株进行能力鉴定和复配的探究，以期解决生产发酵辣椒调味品生产过程中的关键技术问题。

1 材料和方法

1.1 试剂与设备

新鲜红椒、生姜、大蒜、食盐、红星二锅头(52%Vol)：购于贵阳市沃尔玛超市；

戊醇、盐酸：分析纯，重庆川江化学试剂厂；

MRS琼脂培养基、MRS肉汤培养基、LB液体培养基、胰酪胨大豆液体培养基、肉汤琼脂培养基：中国医药上海化学试剂公司；

抗生素纸片：杭州天和微生物试剂有限公司；

植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、植物乳球菌(Lactococcusplantarum)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)：实验室工作人员从自然发酵的辣椒中分离、筛选、鉴定后保留[11]；

紫外分光光度计：UV-2550型，上海元析仪器有限公司；

恒温培养箱：SPX-150C型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化 植物乳杆菌、植物乳球菌、乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌分别用MRS 琼脂培养基斜面活化。条件：(37±1) ℃，48 h，活化3 次[9]。

1.2.2 产酸能力试验 取5 mL菌种接入100 mL培养基中，植物乳杆菌、植物乳球菌和乳酸乳球菌接入到MRS肉汤培养基，枯草芽孢杆菌接种到LB液体培养基，短小芽孢杆菌接种到胰酪胨大豆琼脂培养基，于37 ℃培养48 h，每隔6 h取样测定产酸量。

1.2.3 产酸量的测定 按GB 12456—2008中酸碱滴定法执行。

1.2.4 耐酸性试验 将5 mL待测菌种接种于不同pH值(分别为2.0，3.0，3.5，4.0，5.0)的培养基中，所用培养基同1.2.2，于(37±1) ℃恒温培养48 h。用紫外分光光度计测定波长为480 nm时，培养前、后的OD值，以二者的差值表示各菌种耐酸性(OD值之差越大则菌种的耐酸性越强)[12]。

1.2.5 耐盐性试验 将待测菌接种到1.2.2所述培养基，分别加入5%，9%，13%的氯化钠，于(37±1) ℃恒温培养48 h。用紫外分光光度计测定波长为480 nm时，培养前、后的OD值，以二者的差值表示各菌种耐盐性(OD值之差越大则菌种的耐盐性越强)[13]。

1.2.6 安全性试验

(1) 硫化氢(H2S)试验：取100 mL肉汤琼脂培养基与2.5 mL现配的10%硫代硫酸钠溶液灭菌后混合，冷却至60 ℃，加入3 mL 10%醋酸铅溶液，混合均匀，无菌分装于试管中至5～6 cm，浸于冷水中冷凝成琼脂膏。用接种针蘸取纯培养物，沿管壁作穿刺，培养于37 ℃，1～2 d后观察，培养基变黑色者为阳性，阴性应继续培养至7 d。

(2) 产吲哚(靛基质)试验：将被检菌株接种于蛋白胨水培养基中于(36±1) ℃培养2 d后，加入3滴乙醚，摇动数次，静置1 min，待乙醚上升后，沿试管壁缓缓加入2滴吲哚试剂，在乙醚和培养液之间产生红色环状物为阳性反应。

(3) 抗生素敏感性试验：将抗生素贴纸贴附于已涂布被检菌的培养基表面，于(32±1) ℃培养48 h后，测量记录抑菌圈直径。抗敏性有3种：① 敏感(S)，在常规药量条件下试验菌株可被所用抗菌药物杀死或抑制；② 中介度(I)，为了消除因试验条件及人工读数等不可避免误差而引起的试验偏差，在“S”和“R”之间所设立的缓冲地带；③ 耐药(R)，在常规药量条件下所用抗菌药物并不能对受试菌株起到抑制作用。贴纸种类、药物剂量和抑菌圈判断标准见表1。

表1 药敏试验贴纸药物剂量和纸片解释结果†

† *表示青霉素药物剂量单位为“U”。

(4) 产细菌素试验：在培养基上涂布240 μL大肠杆菌和葡萄球菌，在无菌操作条件下将牛津杯垂直放入培养基中，之后将筛选出菌株的菌液在4 ℃下10 000 r/min离心15 min，将上清液倒入牛津杯中，在(37±1) ℃条件下培养48 h，用直尺直接测量抑菌圈大小，得到抑菌圈直径减去牛津杯直径做记录。

1.2.7 发酵辣椒制备 挑选无杂质、无霉变、无腐烂的鲜红辣椒洗净晾干(不得掺入油)后，按比例加入盐、白糖、酒、大蒜、生姜、复合发酵菌剂，存放于试验要求温度条件下约2 h，将拌有辅料的辣椒翻倒入坛，盛上坛沿水，盖上坛盖，于试验要求温度下发酵。

1.2.8 发酵菌剂的复配以及发酵条件的优化 根据1.2.2～1.2.5的试验结果，选择植物乳杆菌、乳酸乳球菌和枯草芽孢杆菌(菌悬液的浓度为107～108个/mL)作为发酵辣椒的复合发酵菌剂。以1.2.6方法制备发酵辣椒，通过单因素试验和正交试验，对菌种配比与发酵条件进行优化。

(1) 菌种比例对产酸的影响：食盐浓度3%，发酵菌剂接种量5%，发酵时间60 h，发酵温度(32±1) ℃，菌液(枯草芽孢杆菌∶乳酸乳球菌∶植物乳杆菌)体积比=1∶1∶1，2∶1∶1，1∶2∶1，1∶1∶2，1∶2∶2时，酸碱直接滴定测产酸量。

(2) 接种量对产酸的影响：食盐浓度3%，菌液(枯草芽孢杆菌∶乳酸乳球菌∶植物乳杆菌)体积比1∶2∶1，接种量分别1%，3%，5%，7%，9%，发酵温度(32±1) ℃，发酵时间60 h，测产酸量。

(3) 盐浓度对产酸的影响：食盐浓度分别1%，3%，5%，7%，9%，菌液(枯草芽孢杆菌∶乳酸乳球菌∶植物乳杆菌)体积比1∶2∶1，接种量5%，发酵温度(32±1) ℃，发酵时间60 h，测产酸量。

(4) 发酵时间对产酸的影响：食盐浓度3%，菌液(枯草芽孢杆菌∶乳酸乳球菌∶植物乳杆菌)体积比1∶2∶1，接种量5%，发酵温度(32±1) ℃，发酵时间分别为24，36，48，60，72 h，测定产酸量。

(5) 温度对产酸的影响：盐浓度3%，菌液(枯草芽孢杆菌∶乳酸乳球菌∶植物乳杆菌)体积比1∶2∶1，接种量5%，温度分别为30，32，34，36，38 ℃，发酵时间60 h，测得产酸量。

(6) 发酵工艺的优化：在菌液体积比(枯草芽孢杆菌∶乳酸乳球菌∶植物乳杆菌)、接种量、发酵时间和盐浓度的单因素试验基础上，进行正交试验。本试验选取以上4个因素，采用L9(34)正交表。为全面考量产品，以感官鉴定为指标对发酵辣椒的工艺条件进行优化。正交试验结果的分析采用软件SPSS 20.0。

1.2.9 感官评定方法 感官鉴定依据见表2，由20人评分，感官指标评定方法采用模糊数学综合评定方法，选取因素集U={形态，色泽，气味，口味，脆度}，对应的评价集为V={差(5)，较差(10)，良(15)，优(20)}，上述因素的权重集为x={0.05，0.10，0.30，0.35，0.20}。

表2 发酵辣椒感官评定标准

2 结果与分析

2.1 菌种发酵能力测定

2.1.1 产酸能力测定 由图1可知，乳酸乳球菌产酸能力最强，植物乳杆菌相对植物乳球菌后期产酸稍强，短小芽孢杆菌几乎不产酸，枯草芽孢杆菌产酸能力较弱。故优先考虑乳酸乳杆菌、植物乳杆菌。枯草芽孢杆菌为好氧菌，可迅速消耗掉发酵辣椒环境中的氧气，为乳酸菌提供一个良好的无氧环境，故将其列入备选菌种。

图1 乳酸菌产酸能力试验折线图

2.1.2 耐酸性试验 由图2可知，乳酸乳球菌和植物乳杆菌的耐酸性较强，在pH 2.0时仍能生长，但相对较高pH值，生长明显受到抑制；植物乳球菌和枯草芽孢杆菌耐酸性相对较弱，在pH 2.0时几乎不生长；短小芽孢杆菌耐酸性最差，在pH 3.0时其OD差值为负数，可能是短小芽孢杆菌在pH 3.0的条件下出现死亡，细胞裂解自溶。通过此项测试，发现植物乳杆菌和乳酸乳球菌的耐酸性较强，故将此两菌列为复合菌剂菌种首选。

2.1.3 耐盐性试验 一般市场和家庭自用的发酵辣椒口感较好的食盐含量在7%～8%。由图3可知，随着食盐浓度升高，待检的菌株OD差值逐渐下降，即待检菌株菌数逐渐减少，但所筛选的菌株都能在食盐含量7%左右生长，均能达到发酵辣椒产品需求。

图2 筛选菌株耐酸性试验结果分析柱形图

2.1.4 菌株安全性试验 按照1.2.2的方法测得结果见表3～5。

由表3可知，所筛选出来的菌株硫化氢和靛基质试验均为阴性，即不产生硫化氢气体、不产生吲哚。

图3 所筛选菌株耐盐性试验结果分析柱形图

菌种名称硫化氢试验靛基质试验植物乳杆菌 --植物乳球菌 --乳酸乳球菌 --枯草芽孢杆菌--短小芽孢杆菌--

由表4可知，具有抗药性情况为：乳酸乳球菌，2种；植物乳杆菌，3种；植物乳球菌，4种；枯草芽孢杆菌，7种；短小芽孢杆菌，7种。在产酸量和耐盐性都比较理想的前提下，应尽量选择对多种抗生素敏感度较好的菌株来制作微生物发酵菌剂，故优先考虑乳酸乳球菌和植物乳杆菌。

由表5可知，植物乳杆菌和乳酸乳球菌可产生抑菌圈，产生细菌素；植物乳球菌仅对大肠杆菌有抑菌效果。枯草芽孢杆菌虽然产生抑菌圈但都较小；短小芽孢杆菌不产生抑菌圈。故优先考虑植物乳杆菌和乳酸乳球菌。

综上，选取产酸能力、耐酸性、耐盐性、菌株安全性均较好的乳酸乳球菌与植物乳杆菌，且需要耐酸性、耐盐性、菌种安全性相对较好的好氧细菌——枯草芽孢杆菌，为乳酸乳球菌与植物乳杆菌尽快提供无氧环境，提高发酵主菌种的发酵效率。

表4 抗生素敏感性试验结果

表5 菌株产细菌素试验结果†

† - 表示无抑菌圈。

2.2 发酵菌剂的制备

根据单因素试验结果，确定在(36±1) ℃，按表6进行正交试验，结果见表7，方差分析见表8、9。

由表7～9可知，影响产酸量的主次因素：菌液体积比>接种量>发酵时间>盐浓度，菌液体积比、接种量有极显著影响，发酵时间有显著性影响，盐浓度的影响不显著；影响感官评定的主次因素：菌液体积比>接种量>盐浓度>发酵时间，菌液体积比、接种量和盐浓度对其有显著性影响，发酵时间影响不显著。最优配方：菌液(枯草芽孢杆菌∶乳酸乳球菌∶植物乳杆菌)体积比1∶4∶1，接种量6%，发酵时间66 h，盐浓度4%。因A3B3C3D3未出现在正交试验表当中，需验证其优越性，以产酸量和感官评分为考察指标，做3次验证实验取平均值，得到试验结果：产酸量0.77%，感官评分17.525，大于正交表中A3B3C2D1结果，故最优方案为A3B3C3D3，即菌液(枯草芽孢杆菌∶乳酸乳球菌∶植物乳杆菌)体积比1∶4∶1，接种量6%，发酵时间66 h，盐浓度4%。

表6 优化复合菌发酵辣椒工艺条件的正交试验因素与水平

Table 6 Optimization of mixed bacteria fermentation the pepper process conditions on orthogonal experimental factors and level

水平A菌液体积比B接种量/%C发酵时间/hD盐浓度/%11︰2︰1454221︰3︰1560331︰4︰16664

3 结论

通过对所筛菌株进行发酵能力试验，以及对发酵因素的正交优化，确定了最佳工艺条件：菌液(枯草芽孢杆菌∶乳酸乳球菌∶植物乳杆菌)体积比1∶4∶1，接种量6%，发酵时间66 h，盐浓度4%。复合发酵菌剂明显缩短了发酵时间，减少了发酵过程中不确定因素发生的几率，降低了发酵过程品质控制的难度。在发酵辣椒菌剂中加入了好氧菌枯草芽孢杆菌，可以迅速消耗掉发酵辣椒环境中残留的氧气，为其它起主要产酸作用的乳酸菌提供了良好的无氧发酵环境，也可以控制发酵环境中有效成分的氧化，在一定程度上延长了产品的保质期。由于辣椒具有季节性，后续可尝试用干辣椒进行乳酸发酵，以保证企业规模化生产的不间断。

表7 优化复合菌发酵辣椒工艺条件的正交试验结果

表8 复合菌发酵辣椒正交试验结果的产酸量方差分析†

Table 8 Acid production’s orthogonal experimental results of analysis of variance on mixed fermentation chili

方差来源偏差平方和自由度F显著性A0.011234.595**B0.007223.738**C0.00124.595*D0.00122.452误差0.00318总和13.57727

† **表示该因素对试验结果有极显著影响；*表示该因素对试验结果有显著影响。

表9 复合菌发酵辣椒正交试验结果的感官评定方差分析

Table 9 Sensory evaluation score’s orthogonal experimental results of analysis of variance on mixed fermentation chili

方差来源偏差平方和自由度F显著性A132.0142520.088**B14.396256.714**C0.88323.478D3.152212.417**误差2.28418总和152.72927

† **表示该因素对试验结果有极显著影响。

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Preparation of complex microbial inoculants of fermented chilli’s Direct Vat Set (DVS)

SHEN Chang-xuan WANG Xiu-jun ZHU Long-hui HUANG Shan

(1.GuizhouProvincialKeyLaboratoryofFermentationEngineeringandBiopharmacy,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China; 2.SchoolofLiquorandFoodEngineering,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

For developing complex microbial inoculants of fermented chilli and improving production efficiency of fermented industry, the ability of produce acid, acid fastness, salt tolerance and safety of bacterial strains which were separated and identified from natural fermented chilli were determined. AndLactobacillusplantarum,Lactococcuslactis,Bacillussubtiliswere chosen to be alternatives for complex microbial inoculants. The best formula, obtained by experiment of inoculating ratios and majorization of ferment’s condition, were: the proportion ofvolumeofLactobacillusplantarum∶Lactococcuslactis∶Bacillussubtilis=1∶4∶1, the quantity of inoculation 6%, the time of fermentation 66 h, the concentration of salt 4%. It was showed that the inoculating ratio had significant influence on the production of acid content of complex microbial inoculants among the four factors. Under this condition, the fermented chilli’s yield of acid was 0.77%, and sensory evaluation score was 17.525.

fermented chilli; DVS complex microbial inoculants; combination of microbial strain; ability of ferment

贵州省农业攻关项目(编号：黔科合NY字[2012]3018号)；贵州省农业攻关项目(编号：黔科合NY字[2015]3025-1号)

沈畅萱，女，贵州大学在读硕士研究生。

王修俊(1965—)，男，贵州大学教授。 E-mail：775298123@qq.com

2017—03—16

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.06.040