鸭肉中吉他霉素残留的SERS测定

赵进辉 洪 茜 袁海超 刘木华

(1. 江西农业大学工学院，江西 南昌 330045；2. 江西农业大学生物光电及应用重点实验室，江西 南昌 330045)



鸭肉中吉他霉素残留的SERS测定

赵进辉1,2洪 茜1,2袁海超1,2刘木华1,2

(1. 江西农业大学工学院，江西 南昌 330045；2. 江西农业大学生物光电及应用重点实验室，江西 南昌 330045)

应用表面增强拉曼光谱(SERS)法建立一种鸭肉中吉他霉素(KIT)残留的快速检测方法。在分析增强基底的紫外—可见吸收光谱与鸭肉中KIT的SERS光谱的基础上，采用单因素试验法优化了鸭肉中KIT的SERS检测条件，并分别建立了KIT水溶液检测与鸭肉中KIT残留检测的标准曲线。试验结果表明，KIT水溶液检测的标准曲线方程y=0.046 2x+0.215 3，决定系数(R2)为0.927 9，对KIT水溶液预测的平均回收率为99%～123%。鸭肉中KIT残留检测的标准曲线方程为y=0.011 9x+0.940 9，R2为0.923 2，对鸭肉中KIT预测的平均回收率为104%～108%。采用SERS技术检测鸭肉中KIT 残留是可行的。

吉他霉素；表面增强拉曼光谱；鸭肉；检测

吉他霉素(Kitasamycin，KIT)是一种半合成畜禽专用的16元环大环内酯类抗生素[1]5-6。由于KIT比泰乐菌素(Tylosin，TYS)对溶血性巴氏杆菌与畜禽霉形体等有更好的抗菌活性，在预防及治疗鸡、鸭等畜禽呼吸道与肠道疾病中使用广泛且效果良好[1]6-8[2]。但容易造成KIT在鸭等畜禽可食用组织中残留，有潜在危害人们身体健康的可能性[1]11。目前可用于畜禽组织中的KIT等大环内酯类抗生素检测的传统方法有高效液相色谱法[3]、微生物法[4]、气质联用法[5]、液质联用法[6]等。但这些方法往往需要昂贵的仪器设备或复杂耗时的样品处理过程[7]，在鸭肉中的KIT快速检测中较难应用。表面增强拉曼光谱(Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)是一种快速、灵敏的化学与生物化学分析技术，已经在食品污染物检测中表现出了巨大的潜力[8]。Zhang Yuan-yuan等[9]应用表面增强拉曼散射检测鱼组织中的孔雀石绿和无色孔雀石绿残留，Zhai Fu-li等[10]采用SERS来快速检测猪尿中的莱克多巴胺残留,表明采用SERS技术进行鸭肉中的KIT残留快速检测是可行的。基于此，本研究拟在分析增强基底的紫外—可见吸收光谱和鸭肉中KIT的SERS光谱的基础上，分析含KIT的鸭肉提取液的加入量和吸附时间对SERS信号强度的影响，并分别建立KIT水溶液与鸭肉中KIT残留检测的标准曲线，旨在为实现快速检测鸭肉中KIT残留打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验样品

麻鸭：购于江西农业大学菜市场。

1.1.2 试验试剂

吉他霉素标准品：纯度约为92.0%，购于中国物质标准网；

OTR202和OTR103：欧普图斯光学纳米科技有限公司；

乙酸乙酯、正己烷：分析纯，汕头西陇化工股份有限公司。

1.1.3 试验设备

便携式激光拉曼光谱仪：RamTracer-200-HS型，欧普图斯光学纳米科技有限公司；

脑卒中位列全球死亡原因第三位，每年会导致59万人死亡[1]，是成人慢性重度残疾的主要原因，需要长期的康复治疗[2]。在这一过程中，脑卒中后抑郁(post-stroke depression，PSD)是最常见的精神问题，约有33%的患者在脑卒中发作后发展为PSD，其临床主要表现为情绪低落、思维迟缓，以及言语动作减少等典型症状[3-4]。PSD对脑卒中患者的影响主要表现在2个方面：一方面会进一步恶化认知的恢复、身体功能的康复以及生活质量；另一方面会对患者进行康复治疗的能力有负面影响[1]。

超声波清洗器：JK-50B型，合肥金尼克机械有限公司；

漩涡混合器：VORTEX-5型，海门市其林贝尔仪器有限公司；

离心机：JW-1024型，安徽嘉文仪器装备有限公司；

氮吹仪：HSC-24B型，天津市恒奥科技发展有限公司；

实验室超纯水机：T10型，湖南科尔顿水务有限公司；

紫外可见分光光度计：T6系列，北京普析通用仪器责任有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 含KIT的鸭肉提取液加标样本溶液的配置 用搅拌机将麻鸭胸脯肉搅碎，然后用电子天平称取搅碎的鸭胸脯肉5 g，用移液枪取乙酸乙酯10 mL，一起加入到离心管中。将离心管放在漩涡混合器上振荡1 min，用低速离心机离心15 min(4 500 r/min)。用移液枪取上清液4 mL，向其中加入正己烷2 mL，用漩涡混合器涡旋振荡1 min。待其静置分层后，移去下层白色沉淀物。重复处理3次后，用氮吹仪在30 ℃温水浴条件下将其吹干，然后用超纯水定容到4 mL即为鸭肉提取液。将10 mg KIT溶于100 mL鸭肉提取液中得到含100 mg/L KIT的鸭肉提取液加标储备液。用鸭肉提取液将其稀释可得含不同浓度KIT的鸭肉提取液加标样本溶液。

1.2.3 紫外—可见吸收光谱的采集 用T6系列紫外可见分光光度计分别采集金溶胶OTR202和由OTR202、KIT水溶液和OTR103组成的混合溶液的紫外—可见吸收光谱，其光谱的扫描范围为400～700 nm。

1.2.4 SERS光谱的采集 使用便携式激光拉曼光谱仪采集试验样本的拉曼光谱。拉曼光谱仪的参数设置：激光波长785 nm、激光功率200 mW，分辨率6 cm-1，积分时间10 s，积分2次求平均值。待测混合溶液中金胶OTR202、待测样品与OTR103的体积分别为500，20，100 μL。

1.2.5 SERS光谱的前处理方法 样本的拉曼光谱均采集5次，并取平均值进行数据分析。在标定曲线建立前均应用自适应迭代重加权惩罚最小二乘法(air-PLS)扣除样本拉曼光谱中的荧光等背景信号。

2 结果与分析

2.1 增强基底的紫外—可见吸收光谱

由图1可知，金溶胶OTR202的最大吸收峰峰位约在536 nm处，同时拥有较窄的半峰宽(约50 nm)，说明本次使用的ORT202金纳米粒子拥有较均匀的粒径分布和较好的增强潜力；OTR202、KIT水溶液和OTR103组成的混合溶液的最大吸收峰峰位(544 nm)相对于OTR202的峰位红移了约8 nm，同时半宽峰增大。说明KIT分子已经吸附到了增强基底表面。

a. OTR202 b. OTR202+KIT+OTR103

2.2 鸭肉中KIT的SERS分析及归属

由图2可知，鸭肉提取液的主要SERS特征峰为1 557，1 532，1 430，1 370，1 246，1 208，1 198 cm-1；KIT水溶液的主要SERS特征峰为1 564，1 532，1 444，1 364，1 268，1 228，1 208 cm-1；含有KIT的鸭肉提取液的主要SERS特征峰为1 564，1 532，1 438，1 370，1 268，1 228，1 208 cm-1。对比3条光谱曲线可知，1 532，1 370，1 208 cm-1为三者共同的SERS特征峰，同时，含有KIT的鸭肉提取液的SERS特征峰(1 438，1 564 cm-1)分别与鸭肉提取液的SERS特征峰1 430，1 557 cm-1的峰位比较靠近，因此，上述SERS特征峰

a. 鸭肉提取液 b. KIT水溶液 c. 含有KIT的鸭肉提取液

不适合用于检测鸭肉中KIT存在的SERS特征峰。而1 228，1 268 cm-12处SERS特征峰出现在KIT水溶液和含有KIT的鸭肉提取液的SERS光谱曲线上，在鸭肉提取液的SERS光谱曲线上没有出现。 因此，1 228，1 268 cm-1作为判别鸭肉中KIT存在的SERS特征峰，同时为了减小外界因素和光谱分析的非线性，以1 268 cm-1与1 228 cm-1峰高比(I1 268/I1 228)作为变量进行后续分析和处理。1 228 cm-1处SERS特征峰的产生可能与吡喃基团上的C—H剪切振动、C—H和O—H摇摆振动有关，1 268 cm-1处SERS特征峰的产生可能是吡喃基团上的C—H和O—H摇摆振动[11-12]。

2.3 鸭肉中KIT检测条件的优化

为了获得更好的鸭肉中KIT残留的SERS检测效果，本研究尝试优化含KIT的鸭肉提取液的加入量和吸附时间。在固定OTR202(500 μL)和OTR103(100 μL)加入量的条件下，改变含KIT(浓度：15.0 mg/L)的鸭肉提取液加入量，得到如图3(a)所示的变化趋势。由图3(a)可知，随着含KIT的鸭肉提取液加入量的增加，比值I1 268/I1 228呈先增大后减小的趋势，说明增强基底与含KIT的鸭肉提取液之间的体积比会影响比值I1 268/I1 228的大小。同时，当含KIT的鸭肉提取液加入量达到20 μL时，比值I1 268/I1 228达到最大值，基于此，选定含KIT的鸭肉提取液加入量是20 μL。

图3(b)给出了比值I1 268/I1 228随吸附时间的变化趋势图。由图3(b)可知，不同吸附时间比值I1 268/I1 228不同，说明不同吸附时间金纳米粒子OTR202聚集产生的活性热点会对鸭肉中KIT的SERS特征峰强度产生影响。吸附1 min时，比值I1 268/I1 228最大，说明在给定的吸附时间范围内，1 min为较优的吸附时间。

图3 含KIT的鸭肉提取液加入量和吸附时间对SERS信号的影响

Figure 3 Effect of the addition amount of duck meat extract containing KIT and adsorption timeon SERS intensity

2.4 KIT水溶液检测的标准曲线及预测结果

以KIT水溶液的浓度为横坐标，以SERS特征峰比值I1 268/I1 228为纵坐标，建立了KIT水溶液检测的标准曲线。由图4可知，KIT水溶液检测的标准曲线方程y=0.046 2x+0.215 3，决定系数(R2)为0.927 9，说明KIT水溶液浓度(0.05～28.0 mg/L)与比值I1 268/I1 228具有一定的线性关系，水溶液中KIT的最低检测限可达0.05 mg/L。为了验证该标准曲线检测KIT水溶液的可靠性，对不同浓度的KIT水溶液进行预测，结果见表1。由表1可知，对KIT水溶液预测的平均回收率为99%～123%，说明本研究方法的可靠性较好，可为后续建立鸭肉中KIT残留的SERS检测提供依据。

图4 KIT水溶液的标准曲线

实际值/(mg·L-1)预测值/(mg·L-1)平均回收率/%5.05.0937101.8719.023.3132122.7023.022.691098.66

2.5 鸭肉中KIT残留检测标准曲线的确定与预测结果

以鸭肉提取液中KIT浓度为横坐标，以SERS特征峰比值I1 268/I1 228为纵坐标，得到的鸭肉提取液中KIT检测的标准曲线见图5。由图5可知，鸭肉中KIT残留检测的标准曲线方程为y=0.011 9x+0.940 9，R2为0.923 2，表明鸭肉中的KIT浓度与比值I1 268/I1 228呈良好的线性关系。 为了验证该标准曲线检测鸭肉提取液中KIT残留的可靠性，对鸭肉提取液中的KIT残留进行预测，结果见表2。由表2可知，对鸭肉中KIT预测的平均回收率为104%～108%。表明采用SERS方法来检测鸭肉中的KIT残留是可行的。

3 结论

本研究进行了增强基底的紫外—可见吸收光谱与鸭肉中KIT的SERS分析，确定了以峰高比I1 268/I1 228作为鸭肉中KIT残留快速检测的SERS分析特征变量。对含KIT的鸭肉提取液加入量和吸附时间进行优化。KIT水溶液检测的标准曲线方程y=0.046 2x+0.215 3，R2为0.927 9，对KIT水溶液预测的平均回收率为99%～123%。鸭肉中KIT残留检测的标准曲线方程为y=0.011 9x+0.940 9，R2为0.923 2，对鸭肉中KIT预测的平均回收率为104%～108%。

表2 鸭肉提取液中的KIT的预测结果分析

图5 含KIT的鸭肉提取液的标准曲线

[1] 张楠. 替米考星在肉鸭体内生物利用度及组织分布研究[D]. 武汉: 华中农业大学, 2008.

[2] 邬立刚. 不同剂型吉他霉素对肉仔鸡生产性能的影响[J]. 饲料与畜牧, 2012, 21(9): 31-33.

[3] 刘晔. 动物性食品中大环内醋类抗生素残留的HPLC分析[D]. 无锡: 江南大学, 2007: 13-22.

[4] 黄晓蓉, 郑晶, 吴谦, 等. 食品中多种抗生素残留的微生物筛检方法研究[J]. 食品科学, 2007, 28(7): 418-421.

[5] TAKASUKI K, USHIZAWA I, SHOJI T. Gas chromatogra-phy-mass spectrometric determination of macrolide in beef and pork using single ion monitoring[J]. Chromatogr, 1987, 391: 207-217.

[6] HORIE M, HARUMI T, KAZUO T. Determination of macrolide antibiotics in meat and fish by liquid chromatography-electrospray mass spectrometry[J]. Acta Analytica Chimica Acta, 2003, 492(1/2): 187-197.

[7] TAN Hong-liang, CHEN Yang. Silver nanoparticle enhanced fluorescence of enropium(Ⅲ) for detection of tetracycline in milk[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2012, 173: 262-267.

[8] LI Chun-ying, HUANG Yi-qun, PEI Lu, et al. Analyses of Trace Crystal Violet and Leucocrystal Violet with Gold Nanospheres and Commercial Gold Nanosubstrates for Surface-Enhanced Raman Spectroscopy[J]. Food Anal. Methods, 2014, 7(10): 2 107-2 112.

[9] ZHANG Yuan-yuan, YU Wan-song, PEI Lu, et al. Rapid analysis of malachite green and leucomalachite green in fish muscles with surface-enhanced resonance Raman scattering[J]. Food Chemistry, 2015, 169: 80-84.

[10] ZHAI Fu-li, HUANG Yi-qun, LI Chun-ying, et al. Rapid Determination of Ractopamine in Swine Urine Using Surface-Enhanced Raman Spectroscopy[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(18): 10 023-10 027.

[11] 朱自莹, 顾仁敖, 陆天虹. 拉曼光谱在化学中的应用[M]. 沈阳: 东北大学出版社, 1998: 295-307.

[12] 许以明. 拉曼光谱及其在结构生物学中的应用[M]. 北京: 化学工业出版社, 2005: 90-124.

Detection of kitasamycin residues in duck meat using surface-enhanced Raman spectroscopy

ZHAO Jin-hui1,2HONG Qian1,2YUAN Hai-chao1,2LIU Mu-hua1,2

(1. College of Engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang, Jiangxi 330045, China; 2. Optics-Electrics Application of Biomaterials Lab, Jiangxi Agricultural University, Nanchang, Jiangxi 330045, China)

By applying surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS), a rapid detection of Kitasamycin (KIT) residues in duck meat was proposed. On the bases of analyzing UV-visible absorption spectrum of enhanced substrate and SERS of KIT in duck meat, the SERS detection conditions of KIT in duck meat, the addition amount of duck meat extract containing KIT and adsorption time, were optimized by single factor method, and the standard curves for the detection of KIT aqueous solution and KIT residues in duck meat were build respectively. The experiment results showed that the standard curve equation and the coefficient of determination werey=0.046 2x+0.215 3 and 0.927 9 respectively for the detection of KIT in aqueous solution with the average recovery rate of 99%～123%. The standard curve equation and the coefficient of determination werey=0.011 9x+0.940 9 and 0.923 2 respectively for the detection of KIT residues in duck meat with the average recovery rate of 104%～108%.The experiment results showed that it was feasible to detect the KIT residues in duck meat by using SERS technology.

Kitasamycin; surface-enhanced Raman spectroscopy; duck meat; detection

江西省科技厅对外科技合作计划项目(编号：20132BDH80005)；江西省科技厅科技支撑项目(编号：20121BBG70058)

赵进辉，男，江西农业大学副教授，博士。

刘木华(1969—)，男，江西农业大学教授，博士。 E-mail：suikelmh@sohu.com

2017—01—15

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.06.012