文山野生牛肝菌多糖的提取测定及抗氧化性研究

周云波，徐怀春，刘 芳，陈红惠

（文山学院 化学与工程学院，云南 文山 663099）

文山野生牛肝菌多糖的提取测定及抗氧化性研究

周云波，徐怀春，刘 芳，陈红惠

（文山学院 化学与工程学院，云南 文山 663099）

测定文山两种野牛肝菌的蘑菇多糖，并研究其抗氧化性能。以文山野生的黑牛肝菌和白牛肝菌为研究材料，采用水煮醇沉的方法提取了蘑菇多糖，用苯酚—硫酸法测定了含量，用Vc作对比，研究两种牛肝菌多糖对羟基自由基的清除能力,评价牛肝菌多糖的抗氧化活性。研究表明，文山野生的黑牛肝菌、白牛肝菌的多糖含量约为17.3%、29.6%，提取率为0.44%、0.98%；且两种牛肝菌多糖对羟基自由基都具有一定的清除能力，且与浓度呈线性关系，当黑牛肝菌多糖和白牛肝菌多糖的浓度均为10.338 μg/mL时，对羟基自由基的清除能力都达到最强，清除率分别为43.4%和57.7%，略低于Vc的清除率，两种牛肝菌多糖均能清除羟基自由基，都具有抗氧化活性。

野生牛肝菌；牛肝菌多糖；水煮醇沉；苯酚—硫酸法；抗氧化活性

牛肝菌[Xerocomus badius（Fr·）Kiihner exGilb]是菌物界中大型担子菌的重要类型，属担子菌亚门（Basidiomycotina），担子菌纲（Basid-iomycetes），牛肝菌目（Boletales），牛肝菌科（Bole-taceae），下分11～20属，多数可以食用。[1-2]中国牛肝菌科种类有397种和变种，其中有毒牛肝菌33种，占总数8.3%。大部分无毒无苦辣味的种类都可食用。[3-4]云南省牛肝菌类资源丰富，有不少优良的可食品种，主要有白、黄、黑牛肝菌。白牛肝菌，又称美味牛肝菌，牛肝菌富含蛋白质、维生素、多糖、氨基酸和各种矿质元素，其中多糖是一类含有多种活性物质的大分子化合物，是由醛糖和酮糖以糖苷键连在一起的多聚物，可分为同型多糖和异型多糖两大类。[5-7]蘑菇多糖是提高人体免疫力的首选营养品，有较强的抗癌活性，能抑制肿瘤细胞的生长，对致癌物质有吸收。[8]研究表明：活性多糖作为生物效应调节剂，主要作用于机体的免疫系统，具有增强免疫活性、抗衰老、抗肿瘤、抗炎、抗凝血、抗病毒、抗突变、抗辐射、降血脂、降血糖和降血压等多种功能[9-10]，是一种很好的天然有机化合物。

牛肝菌的研究集中在多糖的提取和抗氧化活性的方面。李志洲等[11]对美味牛肝菌的子实体中多糖提取的最佳工艺条件进行了研究，采用溶剂提取的方法确定了美味牛肝菌中多糖提取的最佳提取工艺条件为加水20倍，温度为80 ℃，pH=8时浸提1 h，多糖得率可达7.37%；王一心等[12]研究了黑牛肝菌、华美牛肝菌中的降血脂能力和抗氧化能力，其研究结果表明两种菌都能增加体内清除自由基的能力，在体内有明显的抗氧化作用。西欧各国有广泛食用白牛肝菌的习惯，云南省从1973年起出口白牛肝菌，销往西欧，极受欢迎，供不应求。牛肝菌已成为我国出口创汇的重要菌类产品，仅云南省2002年就出口5 600 t牛肝菌制品，创汇1 700万美元。云南省文山州牛肝菌多糖的提取尚未有人研究，为了更好的开发利用这一野生植物资源，文章主要以云南省文山州野生的黑牛肝菌和白牛肝菌两种菌种为实验材料,采用水煮醇沉法[13]，提取两种牛肝菌多糖，用苯酚—硫酸法[14]，以葡萄糖标品为参照测定其含量；以Vc作对比，利用清除羟基自由基实验Smirnoff的方法[15]来测定两种牛肝菌多糖的抗氧化活性，为开发药食两用的真菌资源提供重要的理论依据。

1 实验材料、试剂及仪器

1.1 实验材料

野生的黑牛肝菌和白牛肝菌，购于文山市。

1.2 主要仪器

分析天平（瑞士普利赛斯XT系列）；DHG9076电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医用光学器械厂）；UV-2550紫外可见分光光度计（日本岛津制作所）；离心机；电热恒温水浴锅；电热套。

1.3 主要试剂

20%三氯乙酸；95%乙醇；无水乙醇；乙醚；5%苯酚；浓硫酸；0.1 mol/L FeSO4溶液；0.1 mol/L水杨酸-乙醇溶液；30 %H2O2溶液;蒸馏水；Vc（抗坏血酸）；葡萄糖标品（GR）。

2 实验方法

2.1 样品的预处理

样品剪碎，烘箱70 ℃烘至恒重，万能粉碎机粉碎，过80目筛，粉末储存于干燥箱中，备用。

2.2 牛肝菌多糖的提取

水煮醇沉法来提取牛肝菌多糖。准确称取黑牛肝菌粉末5.0 g，按液料比1∶20加蒸馏水于烧杯中，于水浴锅提取3次，每次1 h，用纱布过滤得到清液，残渣丢弃。将3次水提取滤液合并，然后在70 ℃恒温水浴锅中进行浓缩。向浓缩液中加入等体积的三氯乙酸（脱蛋白）摇匀，静置过夜，然后离心，取上清液。将上清液加入3倍体积95%的乙醇后，静置醇沉过夜。对醇沉后的溶液进行离心，弃上清液，取沉淀，沉淀依次通过无水乙醇，乙醚进行洗涤，再离心，取离心管中的沉淀，置于滤纸上，于干燥箱中烘干，即可得到黑牛肝菌多糖。同理，采用相同的实验方法来提取白牛肝菌多糖，备用。

2.3 牛肝菌多糖的含量测定

采用苯酚—硫酸法[14]来测定多糖的含量。反应原理：在高温下，多糖与浓硫酸迅速反应生成单糖，单糖在强酸作用下，能与苯酚反应生成橙色衍生物，而且在波长为490 nm处有最大吸收峰。苯酚硫酸试剂可与游离的单糖、寡糖或多糖中的己糖、戊糖、糖醛酸等起显色反应，己糖在波长为490 nm处（戊糖及糖醛酸在480 nm处）有最大吸收峰，且在一定范围内，吸光值与糖含量呈现线性关系。

2.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制

准确称取已经干燥的葡萄糖1.0000 g于容量瓶中，定容到100 mL，此时标准溶液浓度为10.0 mg/ mL。分别移取1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL的标准液于5个50 ml容量瓶中且定容至刻度，摇匀，此时5种溶液浓度分别为0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL。分别移取2.00 mL的5种溶液于干燥试管中，每支试管加入5%苯酚溶液0.50 mL，摇匀。然后分别加入2.50 mL的浓硫酸，充分摇匀后，在室温下静置15 min，然后在波长为490 nm处测得其相应的吸光度值。以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制出葡萄糖浓度与吸光度值之间的标准曲线，得回归线方程和线性范围。

2.3.2 多糖含量的测定

分别称取干燥的黑牛肝菌多糖和白牛肝菌多糖50.0 mg（提取样品重量）于50 mL的容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，摇匀。从两个样品中分别移取2.00 mL于相应的干燥试管中，每支试管加入5%苯酚溶液0.50 mL，摇匀。然后分别加入2.50 mL的浓硫酸，充分摇匀后，在室温下静置15 min，然后用紫外可见分光光度计在波长为490 nm处测得其相应的吸光度值，根据回归线方程来计算出样品中的多糖含量。多糖得率（%）＝纯化多糖质量/原料质量×100%

2.4 牛肝菌多糖抗氧化性的测定

利用清除羟基自由基试验Smirnoff的方法来测定两种牛肝菌多糖的抗氧化活性。试验原理：利用H2O2与亚铁离子混合后，产生·OH，在体系里加入水杨酸以捕捉·OH并产生有色，该有色物质在波长为510 nm处有最大吸收。

在测定多糖含量时，根据苯酚—硫酸法，用紫外分光光度计测得50.00 mL黑牛肝菌多糖的吸光度值为0.620 A，根据回归线方程，可得到其浓度为0.1723 mg/mL。分别移取该浓度溶液1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL于5个50 mL的容量瓶中，均用蒸馏水定容到刻度，摇匀。经计算，5种溶液浓度分别为3.446 μg/mL、6.892 μg/mL、10.338 μg/mL、13.784 μg/mL、17.230 μg/mL。取6支干燥的试管，每支试管均加入1.00 mL 0.1 mol/L的FeSO4溶液，2.00 mL 0.1 mol/L的水杨酸-乙醇溶液，然后从这6支试管中取出5支试管，分别加入2.00 mL的5种不同浓度的溶液，另外一支试管加入2.00 mL的蒸馏水，作为空白对照，最后每支试管均加入2.00 mL的30%的H2O2溶液，然后在37 ℃的水浴锅中反应30 min。以对照组作空白调零，在波长为510 nm处测定各种浓度样品的吸光度值。按相同的方法，对每个浓度样品的吸光度值再进行测定两次，最后取3次吸光度值的平均值。

用电子天平分别精确称取0.0090 g（m＝50.0 mL ×0.1723 mg/mL＝8.615 mg≈0.0090 g）的Vc和白牛肝菌多糖于两个干燥的50 mL的容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，摇匀，则可得两种溶液的浓度均（约）为0.1723 mg/mL。以相同的条件和方法，分别对Vc和白牛肝菌多糖的吸光度值进行3次测定，最后均取平均值。

羟基自由基清除率的计算公式：

·OH清除率（%）＝（A0-Ax）/A0×100%式中：A0——空白对照液的吸光度值Ax——加入多糖液（或Vc液）的吸光度

3 实验结果和分析

3.1 两种牛肝菌多糖的提取

表1 两种牛肝菌多糖的提取质量/g

由表1可知，两种牛肝菌在相同的操作条件下，白牛肝菌所提取得到的粗多糖质量和纯化后多糖质量均大于黑牛肝菌的，且多糖质量的差异较大。

3.2 两种牛肝菌多糖含量的测定

3.2.1 葡萄糖标准曲线绘制

根据苯酚—硫酸法，以水为对照，有关葡萄糖溶液的浓度与相应的吸光度值如表2所示，可根据表中数据绘制出葡萄糖溶液的标准曲线，其标准曲线的回归方程为y＝3.1219x+0.0626，R2=0.9985,如图1所示。

表2 葡萄糖溶液与相应的吸光度值

图 1 葡萄糖标准曲线

由图1可知，R2=0.9985满足测定要求，且葡萄糖溶液的浓度与其吸光度值在测定的范围内存在较好的线性关系，可用于参照分析。

3.2.2 白牛肝菌及黑牛肝菌多糖含量测定

在490 nm波长下测量两种牛肝菌吸光度，并进行相应计算，结果如表3所示。

表3 两种牛肝菌多糖的含量及得率

由表3知，采用同种方法对黑、白两种牛肝菌多糖进行提取，白牛肝菌的多糖含量及多糖得率均比黑牛肝菌的高，且较为明显。

4.3 牛肝菌多糖清除羟基自由基的能力分析

以羟基自由基清除试验Smirnoff的方法,在相同的条件下，分别对黑牛肝菌多糖、白牛肝菌多糖以及Vc的吸光度值进行测定3次，并取相应吸光度值的平均值，其数据记录分别为表4、表5和表6，并根据所得的数据，作出相应的曲线图，如图2所示。

表4 黑牛肝菌多糖溶液对·OH清除率

图 2 三种物质的浓度与·OH清除能力

·OH清除率的计算（以黑牛肝菌多糖1.00 mL组为例）：

·OH清除率＝（1.023-0.650）/1.023×100%＝36.5%

同理：计算出黑牛肝菌多糖其他四组（2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL）的·OH清除率。以此方法，分别计算出白牛肝菌多糖和Vc相应的·OH清除率。

由图2看出，Vc和两种牛肝菌多糖对·OH有显著的清除作用，但三种物质的浓度与·OH的清除能力不成正比关系。其中，Vc、黑牛肝菌多糖及白牛肝菌多糖随着溶液浓度的增加，对·OH的清除能力逐渐增强，当浓度达到10.338 μg/mL时，清除能力都达到最强，清除率分别为60.2%、43.4%和57.7%。随后，随着溶液浓度的增加，Vc和两种多糖对·OH的清除能力也都逐渐减弱。白牛肝菌多糖对羟基自由基的清除能力比黑牛肝菌多糖的清除能力要强，稍弱于Vc的清除能力，但不失为较好的抗氧化新产物。

[1]戴玉成，周丽伟，等.中国食用菌名录[J].菌物学报，2010（1）：1-21.

[2]王向华，刘培贵.云南野生贸易真菌资源调查及研究[J].生物多样性，2002（3）：318-325.

[3]郭永红，杜明英，等.云南野生食用菌——牛肝菌的病害调查研究报告[J].中国食用菌，2004（2）：48-51.

[4]赵永昌，李树红，等.云南宜良县大型真菌调查（续）[J].中国食用菌，2004（6）：5-8.

[5]李平，李娟，等.美味牛肝菌及其深层发酵液中风味物质的研究[J].食用与发酵工业，2007（10）：1-5.

[6]卵晓岚.中国野生食用真菌种类及生态习性[J].真菌学报，1988（1）：36-43.

[7]陈红霞.真菌多糖的活性研究进展[J].生物技术通讯，2005（4）：460-462.

[8]王雪冰，赵天瑞，樊建.食用菌多糖提取技术研究概况[J].中国食用菌，2010（2）：3-6.

[9]梁忠岩，倪秀珍.中草药多糖的应用研究[J].长春师范学院学报，2001（1）：38-40.

[10]芮海云，吴国荣，陆长梅.多糖类生物活性的研究在医药领域的应用[J].淮阳师范学院学报：自然科学版，2002（3）：77-80.

[11]李志洲，邓百万，杨海涛，等.美味牛肝菌最佳提取工艺研究[J].氨基酸和生物资源，2003（3）：27-29.

[12]王一心，杨桂芝，狄勇，等.黑牛肝菌降血脂及抗氧化作用的实验研究[J].大理学院学报，2004（3）：6-8.

[13]张雅君，梁忠岩，张丽霞.党参粗多糖的组成及其免疫活性研究[J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2012（7）：199-202.

[14]Dubois M, Gilles K A, Hamilton J K, et al, Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J]. Analytical Chemistry, 1956,28：350-356.

[15]张莲姬，南昌希，张丽霞.桔梗多糖的提取及其抗氧化作用研究[J].食品与机械，2008（3）：60-63.

（责任编辑 张 铁）

A Study on the Extraction and Antioxidant Activity of Porcini Polysaccharide

ZHOU Yunbo, XU Huaichun, LIU Fang, CHEN Honghui (School of Chemistry and Engineering, Wenshan University, Wenshan Yunnan 663099, China)

In this study, the mushroom polysaccharides of two kinds of porcini (the wild black and white porcini) in Wenshan City have been extracted and determined by the water-extraction and alcohol-precipitation method and the phenol-sulfuric acid method. The antioxidant activity of the two kinds of porcini polysaccharides are evaluated and contrasted with vitamin C through their ability of scavenging hydroxyl radical. As the experimental results show, the polysaccharide content of the wild black and white porcini is about 17.3%, 29.6%, and the rate of extraction is about 0.44%, and 0.98%. Moreover, both black and white porcini polysaccharides have certain activities of scavenging hydroxyl radicals, which are linear with their concentration. When the concentration of black porcini and white porcini polysaccharide gets 10.338 μg/mL, they have the strongest scavenging power to hydroxyl radicals with the clearance of 43.4% and 57.7%. While both are lower than vitamin C’s.

wild Porcini; porcini polysaccharide; water-extraction and alcohol-precipitation; phenol-sulfuric acid method; antioxidant activity

TQ281

A

1674 - 9200（2017）03 - 0024 - 04

2017 - 03 - 17

周云波，女，河南固始人，文山学院化学与工程学院副教授，主要从事天然产物及物理化学研究；徐怀春，男，云南华宁人，文山学院化学与工程学院教授，主要从事有机化学研究；刘芳，女，云南宣威人，文山学院化学与工程学院副教授，硕士，主要从事分析化学研究。