乌司他丁对大鼠重症急性胰腺炎肠黏膜屏障功能的影响

刘 梅 谷 玥 张家玮 刘宝华

(长春市中医院，吉林 长春 130022)



乌司他丁对大鼠重症急性胰腺炎肠黏膜屏障功能的影响

刘 梅 谷 玥1张家玮1刘宝华1

(长春市中医院，吉林 长春 130022)

目的 探讨乌司他丁(UTI)对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠肠黏膜屏障的影响及其作用机制。方法 SD大鼠60只分成对照组、假手术(SO)组、SAP组和UTI组。制模后每隔8 h进行腹腔内注射UTI(浓度1.5万IU/kg)作为UTI组。各治疗组检测制模后8、24、72 h血浆内毒素水平，通过RT-PCR法和免疫组化法对肠黏膜Toll样受体(TLR)4表达进行检测，并在电镜下观察肠黏膜组织。结果 对照组肠黏膜未见TLR4表达。与对照组相比，SAP组在制模后8 h血浆内毒素和肠黏膜TLR4表达即出现升高，并随时间的延长而继续进行性增高。血浆内毒素与肠黏膜TLR4二者明显相关。UTI组同时点内毒素、TLR4低于SAP组，电镜下检查发现病理损伤也同时减轻，24 h时最为明显。结论 UTI能有效保护SAP发生时的肠屏障功能，其保护机制可能与肠黏膜TLR4的表达下调有关。

乌司他丁；Toll样受体4，胰腺炎；肠屏障

重症急性胰腺炎(SAP)往往导致胰腺坏死并继发腹腔感染，从而产生腹腔室隔综合征，继发出现多器官衰竭。而SAP出现继发感染，细菌一般来源于肠道细菌移位〔1〕。如果能有效保护肠黏膜功能屏障，对于预防胰腺坏死，继发腹腔感染，降低患者的死亡率至关重要〔2〕。本研究旨在探讨乌司他丁(UTI)对SAP模型大鼠肠黏膜屏障的影响。

1 材料与方法

1.1 动物分组及模型制备 Wistar雄性大鼠60只，270～320 g，随机分为对照组6只、假手术组(SO)、SAP组和UTI组均18只。戊巴比妥钠麻醉。SO组开腹翻动胰腺后即关腹。SAP组采用微泵逆行胰胆管注射4%牛磺胆酸钠制成SAP模型。SAP制模后腹腔定期注射UTI 1.5万IU/kg，间隔时间8 h，作为UTI组。分别于术后8、24、72 h采血2 ml，高速低温离心，分离血浆后低温保存。切取距回盲部5 cm处回肠肠段6～8 cm，部分肠组织以2.5%戊二醛固定，电镜下观察。部分肠组织固定后用于免疫组化检测。其余肠组织液氮冻存用于RT-PCR检测Toll受体(TLR)4表达。

1.2 检测指标

1.2.1 血浆内毒素水平 使用Mp80微生物快速动态检测系统检测，操作过程按检测系统的操作流程进行。

1.2.2 RT-PCR检测肠黏膜组织TLR4表达 取冻存肠组织约100 mg，提取肠组织细胞的总RNA，取A260/A280>1.6的标本用于实验。半定量检测肠组织TLR4 mRNA的表达。PCR扩增，最后扩增产物条带为356 bp。内参照选择β-actin。通过1.5%琼脂糖凝胶电泳后拍照。用软件进行数据处理，测定目的基因表达的相对含量。

1.3 免疫组化方法检测 肠黏膜TLR4蛋白表达：4%中性甲醛固定的肠组织，S-P法检测TLR4表达。每例切片观察10个具有代表性的高倍视野(400倍)，计数细胞膜或细胞质内呈现棕色的阳性细胞数，切片中阳性细胞比≤5%计0分， 5%～25% 1分；26%～50% 2分； 51%～75%3分；>75% 4分。

1.4 统计学方法 应用SPSS16.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1 各组血浆内毒素水平的动态变化 对照组各时间点间血浆内毒素水平无变化。而SAP组在8 h即出现上升迹象，并呈现进行性增高趋势，制模72 h时达最高。UTI组较对照组增高，但低于SAP组，24 h时下降非常明显(P<0.01)。见表1。

表1 各组血浆内毒素水平比较

与SAP组比较：1)P<0.05

2.2 各组肠黏膜TLR4 mRNA的表达 对照组肠黏膜未检测出明显TLR4 mRNA，SAP组表达从8 h逐渐上升，并在72 h出现最高水平(P<0.01)。UTI组与SAP组比较，表达量在各时点均有所降低，24 h组最低(P<0.05)。见表2。

表2 各组肠黏膜TLR4 mRNA表达比较

与同组8 h比较：1)P<0.01；与SAP组比较：2)P<0.05

2.3 各组肠黏膜TLR4表达比较 见表3。对照组肠黏膜无TLR4阳性表达，SAP组在8 h表达即开始升高，表达量随时间的延长而逐渐增高，72 h达到最高。UTI组与SAP同时点相比TLR4表达量明显降低，其中24 h组最低(P<0.05)。

表3 各组肠黏膜TLR4表达比较

与SAP组比较：1)P<0.05

3 讨 论

目前SAP的病死率仍居高不下。研究表明，在SAP发病早期，由于肠道缺血缺氧、缺血-再灌注损伤及微生物屏障的破坏等多种因素均直接引起患者肠屏障功能障碍。肠道是人体中最大的细菌储存器官，肠屏障一旦受到损伤，肠黏膜通透性随即增加，肠道内细菌及产生的内毒素移位，造成胰腺及胰周组织的严重感染，甚至诱发腹腔室隔综合征和多器官衰竭综合征(MODS)，使胰腺炎病情加重，死亡率上升〔3〕。

UTI能有效抑制内源性氧自由基的产生，阻止多种炎症介质以及内源性休克性因子如白细胞介素(IL)-6、IL-8、髓过氧化物酶(MPO)等产生，进一步增加肠道微循环供血，起到抗休克、预防MODS的作用。UTI还可有效抑制多种消化酶的活性，这些分泌的酶均对胰腺炎发生及发展起到关键作用。

血浆内毒素升高是由于在肠黏膜屏障破坏后，来源于肠道的细菌会通过淋巴系统和门静脉流到血液循环，从而发生肠源性感染。而细菌的细胞壁在血液中破裂会产生内毒素，可进入血液，产生内毒素血症〔4〕。故评估肠黏膜通透性时可以用血浆内毒素水平作为肠黏膜屏障功能的重要指标。TLR4表达升高说明内毒素对肠道黏膜屏障损伤作用加重，它是介导内毒素信号传导的主要受体。本研究发现乌司他丁能够有效降低血浆内毒素水平，并且降低肠黏膜TLR4表达水平。

SAP大鼠肠黏膜TLR4的持续高表达可能是介导肠黏膜过度炎性反应，加重肠黏膜屏障功能障碍的重要原因，而UTI则可能通过下调肠黏膜TLR4受体的表达，抑制炎性反应。本研究发现UTI组与同时相点SAP组相比较，能够明显降低血浆内毒素水平，同时减轻肠黏膜病理损伤。这可能为临床治疗SAP时治疗肠道屏障功能障碍提供一个新的相应措施。

1 Zhang JW,Zhang GX,Chen HL.Therapeutic effect of Qingyi decoction in severe acute pancreatitis-induced intestinal barrier injury〔J〕.World J Gastroenterol，2015;21(12):3537-46.

2 Luan ZG，Zhang H，Ma XC，etal.Role of high-mobility group box 1 protein in the pathogenesis of intestinal barrier injury in rats with severe acute pancreatitis〔J〕.Pancreas，2010;39(2)：216-23.

3 Merilainen S，Makela J，Koivukangas V，etal.Intestinal bacterial translocation and tight junction structure in acute porcine pancreatitis〔J〕.Hepatogastroenterology，2012;59(114)：599-606.

4 王思珍，李维勤.重症急性胰腺炎肠源性细菌易位的研究进展〔J〕.中国实用外科杂志，2013；33(6)：515-8.

〔2017-04-11修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

北京协和医学基金会“睿意基金”急诊医学研究专项基金 (No.R2015024)

刘宝华(1977-)，男，博士，主治医师，主要从事急重症医学研究。

刘 梅(1972-)，女，主治医师，主要从事中医急症研究。

R657.5

A

1005-9202(2017)14-3436-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.024

1 吉林大学第一医院