细胞色素C氧化酶-2/前列腺素E2信号通路对老年慢性阻塞性肺疾病患者肺血管内皮细胞凋亡的作用

许和平 姚津剑 吴多益 丁毅鹏

(海南省人民医院急诊科，海南 海口 570105)



细胞色素C氧化酶-2/前列腺素E2信号通路对老年慢性阻塞性肺疾病患者肺血管内皮细胞凋亡的作用

许和平 姚津剑 吴多益 丁毅鹏

(海南省人民医院急诊科，海南 海口 570105)

目的 探讨细胞色素C氧化酶(Cox)-2/前列腺素E2(PG)E2信号通路对老年慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者肺血管内皮细胞凋亡的作用。方法 该行肺叶切除术的老年患者20例，根据吸烟情况和COPD诊断标准分为非吸烟非COPD组(对照组)6例，吸烟非COPD组(非COPD组)7例，吸烟且COPD组(COPD组)7例，取癌旁正常肺组织为研究标本。TUNEL法检测肺血管内皮细胞凋亡情况；免疫组化染色观察细胞中Cox-2、PGE2蛋白分布情况；RT-PCR检测Cox-2、PGE-2 mRNA表达；Western印迹检测Cox-2、PGE2蛋白的表达。结果 肺血管内皮细胞凋亡指数由高到低依次为COPD组、非COPD组、对照组；Cox-2、PGE2蛋白呈棕色或棕黄色表达于肺血管内皮细胞质并在对照组中表达丰富。非COPD组、COPD组肺组织中Cox-2、PGE2 mRNA表达量明显低于对照组，COPD组明显低于非COPD组(P<0.05)。非COPD组、COPD组肺组织中Cox-2、PGE2 mRNA蛋白表达量明显低于对照组，COPD组明显低于非COPD组(P<0.05)。结论 COPD患者Cox-2、PGE2表达下调，肺血管内皮细胞凋亡增加且与吸烟相关；Cox-2/PGE-2信号通路参与介导COPD患者肺血管内皮细胞凋亡，呈负向调节。

慢性阻塞性肺疾病；内皮细胞；细胞凋亡；细胞色素C氧化酶/PGE2通路

慢性阻塞性肺疾病(COPD)发病机制中肺血管内皮细胞凋亡具有重要地位，COPD与吸烟有关但具体凋亡机制仍未明确〔1〕。细胞凋亡过程中线粒体具有传导和放大凋亡信号的作用，细胞色素C氧化酶(Cox)是位于线粒体内膜上呼吸链末端的限速酶，可通过影响呼吸链功能进而参与线粒体对细胞凋亡的调控〔2〕。相关研究发现，吸烟可明显抑制细胞Cox-2活性〔3〕；COPD患者呼吸肌细胞和骨骼肌细胞中Cox-2表达水平下降〔4〕。前列腺素(PG)E2是Cox-2催化ARA的主要产物，也是Cox-2发挥作用的主要信使。本研究通过观察老年COPD患者肺血管内皮细胞凋亡和肺组织Cox-2、PGE2表达情况，探讨Cox-2/PGE2信号通路的作用及机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年1月至2016年6月因肺癌在海南省人民医院行肺叶切除术的老年患者20例，病理检查均为鳞癌。本次研究经医院伦理委员会批准患者均签署知情同意书。取切除的肺组织中距离肿瘤6 cm以上的癌旁正常肺组织为研究标本。根据吸烟情况和COPD的诊断标准分为非吸烟非COPD组(对照组)6例，男3例、女3例，年龄60～75岁，平均(64.31±8.57)岁；吸烟非COPD组(非COPD组)7例，男4例、女3例，年龄60～78岁，平均(65.08±10.62)岁；吸烟且COPD组(COPD组)7例，男4例、女3例，年龄60～81岁，平均(65.52±9.70)岁。3组患者性别构成、年龄之间差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.2 主要试剂 TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(北京诺博莱德科技有限公司)，Trizol试剂(上海哈灵生物科技有限公司)，鼠抗人Cox-2、PGE2单克隆抗体(上海鲁汶生物科技有限公司)，HRP标记抗小鼠IgG(北京百奥莱博科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 细胞凋亡情况检测 TUNEL法检测肺血管内皮细胞凋亡情况，操作按试剂盒说明书进行，细胞核染色呈深棕色为阳性。每例肺组织标本取3 张切片，每张切片取10个不同视野，分别计数TUNEL阳性细胞数和肺血管内皮细胞总数，两者比值为凋亡指数。

1.3.2 肺血管内皮细胞中Cox-2、PGE2蛋白分布检测 采用免疫组化法检测，肺组织切片常规脱蜡至水并用抗原修复，封闭30 min，滴加鼠抗人Cox-2、PGE2单克隆抗体后冷藏过夜，磷酸缓冲液洗涤后加生物素标记的二抗，37℃孵育90 min，洗涤后加HRP标记抗小鼠IgG，37℃孵育90 min后DAB显色，蒸馏水冲洗，二甲苯透明后封片固定。采集图片，使用Image pro Plus 5.0软件分析。

1.3.3 Cox-2、PGE2 mRNA表达检测 RT-PCR法检测，提取肺组织总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，Trizol法提取并鉴定肺组织总RNA后逆转录得到cDNA。PCR反应体系30 μl，反应条件：10 min预变性94℃，4 min变性94℃，40 s退火56℃，1 min延伸72℃，共40个循环，72℃延伸10 min。扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，Image Scanner Ⅲ扫描仪检测目标条带灰度值，以β-actin为内参计算相对表达量。

1.3.4 Western印迹法检测肺组织Cox-2、PGE2蛋白表达 RIPA蛋白裂解试剂盒提取肺组织总蛋白50 g，行PAGE凝胶电泳，湿法转至PVDF膜，奶粉封闭后滴加鼠抗人Cox-2、PGE2一抗(1∶500稀释)，冰箱冷藏孵育过夜，加入二抗(1∶1 000稀释)，ECL显色并采集图像，用电化学发光法检测。

1.4 统计学分析 采用SPSS21.0软件进行t检验，相关性进行Spearman分析。

2 结 果

2.1 肺血管病理学改变 对照组肺腺泡血管和炎性细胞浸润均较少，血管结构基本正常；非COPD组肺腺泡内血管数量增加，血管腔狭窄，血管壁和内膜增厚，外膜中炎性细胞浸润和色素沉积；COPD组肺组织血管病变更明显，肺腺泡内血管数量和中膜平滑肌厚度明显增加，血管内膜呈肌化型增生。见图1。

2.2 肺血管内皮细胞凋亡及Cox-2、PGE2蛋白分布情况 TUNEL法检测显示，肺血管内皮细胞凋亡指数由高到低依次为：COPD组(14.55±2.10)%、非COPD组(9.82±0.91)%、对照组(5.80±0.52)%。免疫组化染色显示，Cox-2、PGE2蛋白呈棕色或棕黄色表达于细胞质，在对照组中表达丰富，在非COPD组、COPD组中表达依次下降。见图2。

2.3 肺组织中Cox-2、PGE2 蛋白表达情况 非COPD组、COPD组肺组织中Cox-2 蛋白表达量分别为(19.54±0.21)、(15.60±1.85)，明显低于对照组的(24.92±0.28)，COPD组明显低于非COPD组(P<0.05)。PGE2蛋白表达量分别为(36.28±1.95)、(31.05±1.28)，明显低于对照组的(50.81±2.63)，同时COPD组明显低于非COPD组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

2.4 肺组织中Cox-2、PGE-2 mRNA表达情况 非COPD组、COPD组肺组织中Cox-2 mRNA表达量分别为(0.79±0.26)、(0.75±0.28)，明显低于对照组的(0.87±0.35)，同时COPD组明显低于非COPD组(P<0.05)。非COPD组、COPD组肺组织中PGE2 mRNA表达量分别为(2.61±0.83)、(2.18±0.62)，明显低于对照组的(3.27±1.04)，COPD组明显低于非COPD组(P<0.05)。

图1 肺血管形态学变化(HE，×200)

图2 肺血管内皮细胞Cox-2、PGE2蛋白的阳性表达与分布(×200)

图3 Western印迹检测肺组织中Cox-2、PGE2蛋白表达

3 讨 论

COPD是可累及肺血管、气道和肺实质的破坏性疾病。肺血管内皮细胞是气血屏障的重要成分，极易受到炎症、吸烟等血流或气道来源的损伤〔5〕。本研究结果提示血管内皮细胞凋亡参与了吸烟所致的COPD早期的发病。在动物实验中，靶向诱导肺血管内皮细胞凋亡可成功建立慢性阻塞性肺病动物模型〔6〕。进一步表明在COPD发病机制中肺血管内皮细胞凋亡是重要的启动机制之一。 Cox是位于线粒体内膜上呼吸链末端的限速酶，可通过影响线粒体电子传导和膜电位合来调控细胞凋亡。内皮细胞代谢功能活跃，内皮细胞线粒体在生命活动维持方面具有重要作用。目前已发现哺乳动物细胞中Cox共有13个亚基，Cox-2包含细胞色素C结合位点，是Cox的活性中心〔7〕。当Cox-2表达异常时会直接影响Cox的生理功能，与之后的细胞色素C和细胞凋亡之间密切相关，因此可用Cox-2来间接反映Cox整体表达情况。PGE2是Cox-2催化花生四烯酸分泌的主要产物，可影响Cox-2的表达活性。相关研究显示，Cox-2/PGE2信号通路与Apc/Tcf通路有明显相关性，Apc基因突变可提升Tcf转录水平，增加PGE2、Cox-2的表达量〔8〕。本研究结果提示Cox-2/PGE2信号通路参与介导COPD患者肺血管内皮细胞凋亡且呈负向调节，其与Apc/Tcf信号通路的关系需进一步研究。而且吸烟可抑制Cox-2/PGE2信号通路传导，间接导致COPD发生。

1 高恒兴，温中梅，袁海波，等.慢性阻塞性肺病发病机制研究的最新进展〔J〕.中国老年学杂志，2015；35(19)：5668-70.

2 崔德月.COX-2基因单核苷酸多态性与COPD相关性研究〔D〕.苏州：苏州大学，2014.

3 Malhotra S，Deshmukh SS，Dastidar SG，etal.COX inhibitors for airway inflammation〔J〕.Exp Opin Therap Targ，2012；16(2)：195-207.

4 魏海峰，钱 军，鲍丙波，等.微血管形成在腰椎间盘退变过程中的表现特征及影响因素〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2016；17(5)：632-5.

5 肖 建，杜春玲.慢性阻塞性肺疾病病因及发病机制研究进展〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(11)：3191-4.

6 Bernasconi M，Tamm M，Bingisser R,etal.Midregional proatrial natriuretic peptide predicts survival in exacerbations of COPD〔J〕.Chest J Circ Respir Related Systems，2011；140(1)：91-9.

7 Louis Anthony (Tony) Cox.A causal model of chronic obstructive pulmonary disease (COPD) risk〔J〕.Risk Analysis，2011；31(1)：38-62.

8 郑春燕.COX-2介导川芎嗪抑制肺癌A549细胞侵袭转移的作用研究〔D〕.济南：山东大学，2012.

〔2016-12-27修回〕

(编辑 郭 菁/滕欣航)

丁毅鹏(1961-)，男，博士，主任医师，硕士生导师，主要从事慢性阻塞性肺疾病、哮喘研究。

许和平(1983-)，男，硕士，主治医师，主要从事急危重症、呼吸道感染研究。

R569

A

1005-9202(2017)14-3432-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.022