TGF-β1、Smad7在老年星形细胞瘤患者术后组织中的表达及其相关性

马志君 吉 洁 李春辉 谢云鹏 王 广 王维兴

(承德医学院附属医院神经外科，河北 承德 067000)



TGF-β1、Smad7在老年星形细胞瘤患者术后组织中的表达及其相关性

马志君 吉 洁1李春辉2谢云鹏 王 广 王维兴

(承德医学院附属医院神经外科，河北 承德 067000)

目的 探讨转化生长因子(TGF)-β1、Smad7在老年星形细胞瘤患者术后组织中的表达及其相关性。方法 接受手术治疗的老年星形细胞瘤患者25例为研究组。取术中切除的星形细胞瘤组织标本，分为低级别(Ⅰ～Ⅱ级)11例，高级别(Ⅲ～Ⅳ级)14例；另收集本院行内减压术切除的额颞叶正常脑组织6例为对照组。免疫组化染色检测TGF-β1、Smad7在星形细胞瘤及正常脑组织中的表达，RT-PCR检测TGF-β1、Smad7 mRNA表达水平。结果 TGF-β1、Smad7主要表达于正常脑组织和星形细胞瘤组织的细胞质，为黄色或棕黄色颗粒，细胞膜和细胞核均无明显阳性表达；各组间TGF-β1、Smad7表达水平差异均有显著统计学意义(P<0.01)，TGF-β1、Smad7的阳性表达率由高到低依次为：高级别星形细胞瘤、低级别星形细胞瘤、正常脑组织，TGF-β1与Smad7之间呈明显正相关。正常脑组织、低级别星形细胞瘤、高级别星形细胞瘤中TGF-β1 mRNA和Smad7 mRNA表达量逐渐增加，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 TGF-β1、Smad7表达与老年星形细胞瘤的病理分级呈正相关，TGF-β1/Smad信号通路参与了星形细胞瘤的异常增殖。

星形细胞瘤；转化生长因子(TGF)-β1；Smad7

老年星形细胞瘤约占脑肿瘤发病率的40%，恶性增殖和侵袭是其主要的生物学行为〔1〕；治疗以手术为主，但难以彻底切除肿瘤，术后复发率高，预后差。研究显示，上皮细胞增殖的负性调节系统转化生长因子(TGF)-β1/ Smad信号通路在细胞增殖和凋亡的调控机制中发挥重要作用，同时也是机体抑癌的中心环节〔2〕。本实验旨在检测不同分级星形细胞瘤中TGF-β1和Smad7表达情况及其在老年星形细胞瘤发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 收集2015年1月至2016年6月承德医学院附属医院接受手术治疗的老年星形细胞瘤患者25例为研究组，取术中切除的星形细胞瘤组织标本。男16例，女9例；年龄60～78〔平均(67.05±8.31)〕岁；标本按WHO分型标准分为：低级别(Ⅰ～Ⅱ级)11例，高级别(Ⅲ～Ⅳ级)14例。另收集本院行内减压术切除的额颞叶正常脑组织6例作对照组。兔抗人TGF-β1多克隆抗体、兔抗人Smad7多克隆抗体均购于上海信裕生物科技有限公司；免疫组化MaxVision试剂盒购于北京雅安达生物技术有限公司；二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购于上海心语生物科技有限公司；Trizol试剂盒购于上海联硕生物科技有限公司；乙二胺四乙酸(EDTA)、氯仿、乙醇、焦碳酸二乙酯(DEPC)购于湖北欣恒源科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化染色 10%甲醛溶液固定标本，石蜡包埋、切片，水浴修复抗原，链霉菌素抗生物蛋白-过氧化物酶连接法(SP)免疫组化二步法检测TGF-β1、Smad7蛋白表达情况，抗体均按1∶100稀释，磷酸缓冲液(PBS)代替一抗为阴性对照，用已知的星形细胞瘤组织切片为阳性对照；二氨基联苯胺(DAB)显色5 min，苏木素轻度复染，二甲苯透明，封片后镜检。阳性结果为黄色或棕黄色，评定采用Volm双评分法，高倍镜视野下选取10个区域：①阳性细胞比例评分：1分(<25%)、2分(25%-50%)、3分(>50%)；②染色强度评分：0分(无色)、1分(浅黄色)、2分(黄色)、3分(棕黄色)。综合两项评分：0分为阴性，1～2分为弱阳性，3～4分为中阳性，5～6分为强阳性。

1.2.2 RT-PCR检测TGF-β1、Smad7 mRNA表达水平 取200 mg星形细胞瘤组织，Trizol 试剂盒提取总RNA，紫外分光光度法检测浓度符合要求后取1 μg总RNA为模板逆转录成cDNA；RT-PCR反应体系40 μl(cDNA 4 μl，上游引物、下游引物各1 μl，TaqDNA聚合酶20 μl，蒸馏水14 μl)，引物由上海江林生物科技有限公司合成，常规反应条件下循环32次，72℃延伸5 min。取20 μl产物和10 μL DNA Ladder行琼脂糖凝胶电泳，摄像后用Image-Pro Plus6.0软件读取条带的积分光密度值。

1.3 统计学方法 应用SPSS21.0软件进行t、秩和检验、Spearman相关分析。

2 结 果

2.1 各组间TGF-β1、Smad7免疫组化染色情况比较 TGF-β1、Smad7主要表达于正常脑组织和星形细胞瘤组织的细胞质，为黄色或棕黄色颗粒，细胞膜和细胞核均无明显阳性表达，各组间TGF-β1、Smad7表达水平有显著差异(P<0.01)，TGF-β1、Smad7的阳性表达率由高到低依次为：高级别星形细胞瘤、低级别星形细胞瘤、正常脑组织，TGF-β1与Smad7之间呈明显正相关(r=0.951，P<0.05)。见表1，图1。

表1 TGF-β1、Smad7在各组间免疫组化染色情况比较〔n(%)〕

图1 TGF-β1、Smad7在星形细胞瘤组织中免疫组化染色情况(×400)

2.2 各组间TGF-β1、Smad7 mRNA表达量比较 正常脑组织、低级别星形细胞瘤、高级别星形细胞瘤中TGF-β1 mRNA表达量分别为：0.19±0.03、0.63±0.07、0.90±0.10，Smad7 mRNA表达量分别为：0.09±0.02、0.20±0.04、0.45±0.05；随星形细胞瘤级别升高TGF-β1、Smad7 mRNA 表达量明显增加，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2，图3。

M：DNA Marker；1：正常脑组织；2：低级别星形细胞瘤组织；3：高级别星形细胞瘤组织；下图同图2 TGF-β1 mRNA在星形细胞瘤组织中表达情况

图3 Smad7 mRNA在星形细胞瘤组织中表达情况

3 讨 论

星形细胞瘤是颅内最为常见的原发性神经上皮性肿瘤。星形细胞瘤恶性增殖及侵袭性生长是其主要的生物学行为。目前，星形细胞瘤的治疗方案中仍首选手术，但难以完全切除病灶组织，复发率高，预后差，在机体功能明显衰退的老年患者中更为明显。星形细胞瘤组织产生与发展是一个多因素共同参与的长期复杂过程，具有多种病理生理机制〔3〕。

TGF-β属于多肽类生长因子，总共5种异构体，只有TGF-β1～β3 3个亚型在哺乳动物中表达〔4〕。其中TGF-β1是人体内的主要存在形式，它不仅调控细胞的发育，还可抑制免疫系统、影响血管生成等多种活性。TGF-β1可通过影响下游相关受体及Smad蛋白来调控细胞的增殖和分化，对良、恶性细胞均可发挥重要作用〔5〕。在上述调控通路中任何元件表达异常均可能导致信号异常转导，进而对TGF-β1的正常细胞生物学效应产生不良影响，诱发肿瘤的侵袭与转移。

Smads蛋白作为TGF-β信号通路中的重要元件，具有细胞核移位功能和转录因子活性〔6〕。当Smads蛋白异常表达时会影响正常的信号传导，诱导恶性肿瘤产生。Smad7基因所处的染色体位置对应的等位基因缺失见于多种恶性疾病，并且与死亡率高、易发生转移有关〔7〕。TGF-β/Smad信号传导通路中的抑制因子Smad7在TGF-β信号传导过程中起负反馈调节作用，其能够与活化的TGF-β受体相互结合，抑制细胞质中Smad蛋白磷酸化，阻断TGF-β信号转导，影响细胞对TGF-β信号的应答。本研究说明TGF-β1、Smad7过表达能够促进星形细胞瘤的发生，并提升了星形细胞瘤的增殖速度。TGF-β1/ Smad信号通路是体内重要的抑癌系统，TGF-β1抑制信号的传导是通过TGF-β1受体传入，随后活化Smad2、3，再与Smad4结合后进入细胞核调节基因转录、抑制肿瘤生长的。但相关研究发现，肿瘤细胞中TGF-β1抑制作用常失效，反而发挥促进作用，与TGF-β/Smads信号传导紊乱有关〔8〕。TGF-β1信号传导过程中Smad7发挥负反馈和抑制的作用，Smad7蛋白异常表达时，可抑制Smad磷酸化，阻断TGF-β1抑制信号传导，促进肿瘤形成。

1 宋 军，王颖翠，谢宗凯，等.弥漫性浸润型星形细胞瘤中单丝氨酸蛋白激酶1、基质金属蛋白酶-14和血管内皮生长因子的表达及意义〔J〕.中国老年学杂志，2013；33(23)：6004-5.

2 Zamfir AD，Fabris D，Capitan F，etal.Profiling and sequence analysis of gangliosides in human astrocytoma by high-resolution mass spectrometry〔J〕.Anal Bioanal Chem，2013；405(23)：7321-35.

3 苗 红.脑星形细胞瘤磁共振波谱与肿瘤细胞的Ki-67、bcl-2相关性研究〔D〕.大连：大连医科大学，2010.

4 Mazloom A，Hodges JC，Teh BS，etal.Outcome of patients with pilocytic astrocytoma and leptomeningeal dissemination〔J〕.Int J Radiat Oncol Biol Phy，2012；84(2)：350-4.

5 Hallemeier CL，Pollock BE，Schomberg PJ，etal.Stereotactic radiosurgery for recurrent or unresectable pilocytic astrocytoma〔J〕.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2012；83(1)：107-12.

6 孙红霞，陈建光.北五味子多糖对异丙肾上腺素致大鼠心室重构的保护作用〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2015；16(1)：34-7.

7 刘政操.星形细胞瘤血管生成拟态的形态观察及恩度抑制肿瘤与肿瘤血管形成相关分子机制的实验研究〔D〕.沈阳中国医科大学，2011.

8 Kotulska K，Borkowska J，Roszkowski M，etal.Surgical treatment of subependy mal giant cell astrocytoma in tuberous sclerosis complex patients〔J〕.Pediatr Neurol，2014；50(4)：307-12.

〔2017-02-13修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

吉 洁(1978-)，女，硕士，主治医师，主要从事妇科肿瘤、妇科内分泌研究。

马志君(1977-)，男，硕士，主治医师，主要从事颅脑损伤、颅脑肿瘤、脑血管病、癫痫研究。

R73

A

1005-9202(2017)14-3425-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.019

1 承德医学院附属医院病案室 2 承德医学院附属医院病理科