强制性运动疗法对老年脑卒中大鼠神经功能和碱性成纤维生长因子表达的影响

王淑玲 刘 佳 邓景贵 宋 涛 方翠霓 刘楚娟 陶 希 唐雪琴

(湖南省人民医院老年医学研究所，湖南 长沙 410016)



强制性运动疗法对老年脑卒中大鼠神经功能和碱性成纤维生长因子表达的影响

王淑玲 刘 佳1邓景贵1宋 涛1方翠霓1刘楚娟1陶 希1唐雪琴1

(湖南省人民医院老年医学研究所，湖南 长沙 410016)

目的 探讨强制性运动疗法(CIMT)对老年脑卒中大鼠神经功能和碱性成纤维生长因子(bFGF)表达的影响。方法 将90只SD大鼠按照随机数字表法分为CMIT组、常规康复组及对照组，每组30只，采用Zea Longa线栓法制备脑卒中模型，给予CMIT组以固定健侧上肢，强迫患侧肢体进行滚筒、平衡木、网屏训练；常规康复组以不限制健侧上肢进行滚筒、平衡木、网屏训练，训练时间与CIMT相同，每天训练时间上下午各15 min；对照组无任何训练，21 d后训练停止，各组大鼠饲养条件相同，实验干预7、14、21 d对大鼠进行行为功能(滚筒训练评分、平衡木测试评分、网屏抓握测试评分)及神经功能评定；采用real-time PCR方法检测bFGF、表皮生长因子(EGF)的mRNA表达，Western印迹法检测bFGF、EGF的蛋白水平。结果 CMIT组、常规康复组康复训练后行为功能及神经功能评分均明显降低(P<0.05)，且CMIT组21 d后行为功能评分，14、21 d神经功能评分均低于常规康复组(P<0.05)；CMIT组和常规康复组在康复训练7、14、21 d，bFGF和EGF蛋白及mRNA表达均高于对照组(P<0.05)，CMIT组在康复训练14、21 d，bFGF和EGF蛋白水平及mRNA表达均高于常规康复组(P<0.05)。结论 强制性运动疗法与康复训练相比，可以更好地促进出血性脑卒中大鼠肢体功能的恢复，其机制可能与促进bFGF和EGF表达有关。

强制性运动疗法；脑卒中；神经功能；碱性成纤维生长因子

偏瘫是脑卒中最为严重的后遗症，主要表现为患者运动障碍〔1〕。对于脑卒中治疗不仅需要挽救患者生命，而且更加需要改善患者生活自理能力和生活质量〔2〕。强制性运动疗法(CIMT)是主要用于脑卒中恢复期上肢功能训练康复的治疗技术，效果显著〔3〕。临床研究显示经过早期CIMT可能通过促进神经营养因子参与脑卒中患者功能恢复〔4〕。碱性成纤维生长因子(bFGF)的作用是促进内皮细胞的游走和平滑肌细胞的增殖，不能使平滑肌细胞游走，能够促进新血管形成，修复损害的内皮细胞〔5〕。本文旨在探讨CIMT对脑卒中大鼠神经功能和bFGF表达的影响。

1 资料与方法

1.1 实验动物 动物：购买湖南斯莱克景达动物有限公司健康清洁级SD大鼠90只，体重220～300 g，月龄12个月，大鼠购回后按照养殖环境为24℃～25℃，自由供水，给予颗粒普通大鼠饲料。进行14 d养殖，状态稳定后进行实验。将90只SD大鼠按照随机数字表法分为CMIT组、常规康复组及对照组，每组30只。

1.2 研究方法

1.2.1 建立老年SD大鼠脑卒中模型 根据Zea Longa线栓法，腹腔麻醉，切开颈部皮肤，分离颈部动脉，包括颈内动脉(ICA)、劲外动脉(ECA)、左侧颈总动脉(CCA)，结扎ECA及颈总动脉近心端。在颈总动脉近分叉处插入备用鱼线，将栓线送至大脑中动脉分叉处，平均进线(18.5±0.5)mm(ECA与ICA分叉处为起点)，栓线尾端留于皮肤外，栓塞90 min后抽线实现再灌注。以动物清醒后爬行时右转圈，提尾时右前肢内收屈曲为入选标准。

1.2.2 康复训练 CMIT组大鼠固定健侧上肢，强迫患侧肢体进行滚筒、平衡木、网屏训练，每天训练时间上下午各15 min；常规康复组以不限制健侧上肢进行滚筒、平衡木、网屏训练，训练时间与CIMT相同；对照组无任何训练。CIMT组和常规康复组从术后第3天生命体征平稳开始训练，21 d后训练停止，各组大鼠饲养条件相同。(1)滚筒训练：采用德国制造的滚筒式网状训练器进行训练，包括一个可旋转的网状笼，一个固定架底座。按5 r/min进行转笼训练，每天强化训练和一般强度训练时间相同，上下午各15 min。(2)平衡木训练：取170 cm长、2 cm宽的方木，距地面7 cm处平放，大鼠可在上面爬行，每天强化训练和一般强度训练时间相同，上下午各15 min。(3)网屏训练：网屏为50 cm×40 cm纱网，网眼均为1 cm×1 cm 大小，下边放一个12 cm厚的软海绵垫。将受试大鼠置于平放的网屏上，再缓慢抬高网屏的一端到80 cm的地方，观察大鼠是否抓住网屏或掉下。每天强化训练和一般强度训练时间相同，上下午各15 min。

1.2.3 大鼠脑卒中侧组织中bFGF、表皮生长因子(EGF)的mRNA表达 提取脑卒中侧组织总RNA，逆转录后采用real-time PCR方法检测bFGF、EGF的mRNA水平变化。实验试剂：RNA提取试剂盒(Code No.9767，TAKARA公司)、反转录试剂盒(Code No.RR047A，TAKARA公司)、real-time PCR试剂盒(Code No.RR820A，TAKARA公司)，选择参比基因为β-actin，引物设计：β-actin编号AY618569，正义5'-CTGACGGCCAGGTCATCACTA-3',反义:5'-CCAAGAAGGAAGGCTGGAAAAGA-3';bFGF编码XM_006535399，正义:5'-CTTTAGGAGCTGCGTCACCG-3',反义:5'-AGCCCCTTGAGTGTACAACG-3';EGF编码NM_001329594.1，正义：5'-TCAGACGGAGAGACTGCTGA-3',反义:5'-GGTGCGGTAGAGTCGAAACA-3'。

1.2.4 大鼠脑卒中侧组织中bFGF、EGF蛋白质水平 实验7、14、21 d各处死10只大鼠，提取脑卒中侧组织总蛋白质，采用Western印迹方法，利用bFGF抗体和EGF抗体，检测各组大鼠脑卒中侧组织中bFGF、EGF的蛋白水平。

1.3 研究指标 实验7、14、21 d对大鼠进行行为功能及神经功能评定，行为功能〔6〕：(1)滚筒训练评价。0分：鼠可在上面行走；1分：鼠不会掉下来，超过1 min；2分：鼠从棒上掉下来；3分：开始前鼠就掉下来。(2)平衡木测试。该项目评分标准共分6个等级。0分：大鼠在平衡木上移动且不会掉下；1分：在平衡木上移动，掉下机会≤50%；2分：在平衡木上移动，掉下机会>50%；3分：在平衡木上健侧代偿，患侧不负重；4分：在平衡木上不移动不掉下；5分：在平衡木上不能保持即掉下。(3)网屏抓握测试。该项目共分4个评分标准。0分：大鼠前爪抓网屏约5 s不掉下；1分：大鼠可抓住网屏但滑落一段距离，没有掉下；2分：在5 s内从网屏上掉下；3分：网屏竖立时大鼠即可掉下。神经功能评定〔9〕：15分制评分标准进行2分：评分，0分：无神经功能损伤症状；1分：不能屈曲对侧前爪；2分：向外侧转圈；3分：向对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。

1.4 统计学方法 应用SPSS13.0软件进行t检验、方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1 3组各时间点行为功能评分比较 对照组经过滚筒训练、平衡木测试、网屏抓握测试均为0分。经过康复训练后，CMIT组、常规康复组行为功能评分均有所下降(P<0.05);且CMIT组21 d行为功能评分均低于常规康复组(P<0.05)。见表1。

2.2 3组不同时间点神经功能评分比较 CMIT组、常规康复组康复训练后神经功能评分有下降的趋势，差异有统计学意义(F=6.378，6.231；均P=0.000)，对照组差异不显著(F=0.879,P=0.189)；康复训练7 d神经功能评分3组间差异无统计学意义(P>0.05)，康复训练14、21 d 3组间差异有统计学意义(P<0.05)，且CMIT组和常规康复组评分低于对照组，CMIT组低于常规康复组(P<0.05)。见表2。

表1 3组各时间点行为功能评分比较分)

与本组7 d比较：1)P<0.05

2.3 大鼠脑卒中侧组织中bFGF、EGF蛋白水平比较 bFGF和EGF蛋白经过康复训练同一时间点3组间差异有统计学意义(P<0.05)，其中CMIT组和常规康复组在康复训练7、14、21 d bFGF和EGF蛋白水平均高于对照组(P<0.05)，CMIT组在康复训练14、21 d bFGF和EGF蛋白水平均高于常规康复组(均P<0.05)。见表3。

2.4 大鼠脑卒中侧组织中bFGF、EGF mRNA相对表达 bFGF和EGF mRNA表达经过康复训练同一时间点3组间差异有统计学意义(P<0.05)，其中CMIT组和常规康复组bFGF和EGF mRNA表达在康复训练7、14、21 d均显著高于对照组(P<0.05)，CMIT组在康复训练14、21 d均显著高于常规康复组(P<0.05)。见表4。

表2 3组不同时间点神经功能评分比较分)

与对照级比较：1)P<0.05;与常规康复组比较：2)P<0.05；下表同

表3 大鼠脑卒中侧组织中bFGF、EGF蛋白水平比较

表4 大鼠脑卒中侧组织中bFGF、EGF mRNA相对表达水平比较

3 讨 论

根据流行病学现况研究显示我国脑卒中的发病率和死亡率明显高于心血管病，脑卒中除了发病率高，死亡率高外，其更重要的特点是致残率高〔8〕。据WHO统计，约有80%的脑卒中患者留有不同程度的残疾，包括智力残疾、肢体残疾等〔9〕。脑卒中并发偏瘫，临床上认为脑卒中后偏瘫上肢恢复的最佳时间是3个月内。脑损伤恢复分为自发和治疗两种，其中治疗功能恢复是在患者不能自发恢复情况给予临床干预，其中脑功能是否可塑是治疗关键，这也是脑卒中后功能康复的主要机制〔10〕。

CMIT是从动物实验中发现，主要以强化训练患侧、控制健康为主，达到强制使用和强化训练患肢的目的，能明显提高脑卒中后患侧上肢的灵活性，但目前的研究多数为个案报道或小样本研究〔11〕。神经干细胞(NSC)是神经可塑性研究方向最重要的热点。研究结果说明网屏抓握训练效果较滚筒训练、平衡木测试稍微灵敏，三者康复训练均优于常规训练模式，且康复训练有利于患者功能恢复，并且早期CMIT促进患者疾病恢复效果更加明显。

bFGF是一种生物活性很强的促分裂因子和极具临床应用价值的神经营养因子。研究表明〔12〕，在脑卒中等病理状态下，内源性NSC会发生增殖现象，参与神经修复，并且以bFGF、EGF为代表的细胞因子是最重要的一种，bFGF促使干细胞向着生成神经元的方向分化，其刺激作用出现早，可维持时间较长；而EGF在NSC增殖晚期促进神经前体细胞的增殖和分化，bFGF在NSC增殖早期发挥促有丝分裂作用，使NSC获得对另一种作用更强的促有丝分裂因子EGF的反应性，在增殖后期EGF对NSC的增殖刺激作用明显增强。本研究结果说明CMIT可能通过上调bFGF和EGF水平林而促进出血性脑卒中大鼠肢体功能的恢复。

1 Li N,Wang P,Ma XL,etal.Effect of bone marrow stromal cell transplantation on neurologic function and expression of VEGF in rats with focal cerebral ischemia〔J〕.Mol Med Rep,2014;10(5):2299-305.

2 刘 波,赵 磊.早期康复训练对急性脑卒中患者日常生活能力的影响〔J〕.宁夏医科大学学报,2013;35(1):89-90.

3 李 琦,钟纯正,李文斌,等.早期强化步行基本功训练对脑卒中的预后分析〔J〕.现代生物医学进展,2013;13(27):5306-9.

4 黄红红,王凌星,张泉香,等.强制性运动疗法对脑卒中亚急性早期偏瘫患者上肢功能恢复的影响〔J〕.中华物理医学与康复杂志,2014;36(11):838-41.

5 曾贵刚,李 峻,张 申,等.fMRI结合神经症状评分评价运动疗法对大鼠局灶性脑缺血模型的疗效〔J〕.实验动物与比较医学,2011;31(4):236-41.

6 Etoom M,Hawamdeh M,Hawamdeh Z,etal.Constraint-induced movement therapy as a rehabilitation intervention for upper extremity in stroke patients:systematic review and meta-analysis〔J〕.Int J Rehabil Res,2016;39(3):197-210.

7 Bang DH,Shin WS,Choi HS.Effects of modified constraint-induced movement therapy combined with trunk restraint in chronic stroke:a double-blinded randomized controlled pilot trial〔J〕.Neuro Rehabilitation,2015;37(1):131-7.

8 龚素芬,邢凤梅,唐惠艳,等.护士及家属对脑卒中患者功能康复训练知识认知的研究进展〔J〕.中国老年学杂志,2011;31(6):1075-6.

9 万 钧,朱 敏,杨晓炜,等.老年脑卒中患者下肢深静脉血栓形成的原因及其危险因素〔J〕.中国老年学杂志,2013;33(16):4022-3.

10 郭 丽,郭艳峰,赵宗茂,等.胰岛素样生长因子-1对局灶性脑缺血大鼠神经功能评分及碱性成纤维生长因子表达的影响〔J〕.中华行为医学与脑科学杂志,2014;23(2):110-3.

11 张立峰,王丽岩,李凌雁,等.头电针联合强制性运动对缺血脑卒中大鼠抗细胞凋亡调控机制研究〔J〕.针灸临床杂志,2016;32(1):68-72.

12 Chen YP,Pope S,Tyler D,etal.Effectiveness of constraint-induced movement therapy on upper-extremity function in children with cerebral palsy:a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials〔J〕.Clin Rehabil,2014;28(10):939-53.

〔2017-03-11修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

湖南省2013年第二批省级科技计划项目(No.2013FJ3117)；2012年湖南省自然科学常德联合基金计划项目(No.12JJ9029)

刘 佳(1963-)，女，主任医师，主要从事神经康复研究。

王淑玲(1984-)，女，硕士，助理研究员，主要从事神经康复研究。

R743.3

A

1005-9202(2017)14-3403-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.010

1 湖南省人民医院康复医学科