血管加压素联合肾上腺素对心搏骤停大鼠心肌细胞PERK-Nrf2信号通路的影响

刘月英 胡光瑞 于亚男

(香港大学深圳医院，广东 深圳 518000)



血管加压素联合肾上腺素对心搏骤停大鼠心肌细胞PERK-Nrf2信号通路的影响

刘月英 胡光瑞 于亚男1

(香港大学深圳医院，广东 深圳 518000)

目的 探讨血管加压素和肾上腺素对心搏骤停大鼠心肌细胞内质网应激PERK-Nrf2通路的作用。方法 构建大鼠心搏骤停模型后，随机分为心搏骤停组(CA组)、肾上腺素治疗组(Epi组)、血管加压素治疗组(Vp组)和血管加压素联合肾上腺素治疗组(Epi+Vp组)。3个心搏骤停复苏成功1 h后留取尾静脉血，进行血清学检测。留取大鼠心肌组织行Western印迹法检测心肌组织中GRP78、PERK和Nrf2的表达水平。结果 血清学检测发现，与CA组相比，Epi组、Vp组和Epi+Vp组的还原型谷胱甘肽水平明显增加。Western印迹结果显示，与CA组相比，Epi组、Vp组和Epi+Vp组心肌组织中GRP78蛋白的表达明显增加(P<0.01)。同时发现与CA组相比，Epi组和Vp组PERK和Nrf2蛋白增加(P<0.05)，Epi+Vp组PERK和Nrf2蛋白明显增加(P<0.01)。结论 血管加压素联合肾上腺素通过活化PERK-Nrf2通路增加心搏骤停大鼠心肌细胞的抗氧化能力，增加心肌保护性作用。

心搏骤停；血管加压素；肾上腺素；PERK-Nrf2通路

心搏骤停发病率高，复苏困难，愈后差，特别是在低血容量性休克和器质性心脏病等人群中。心搏骤停在复苏过程中，心肌损伤的主要原因为心肌缺血和再灌注损伤，现阶段认为在缺血-再灌注过程中，与心肌细胞线粒体损伤、细胞内活性氧的增加和热休克蛋白表达增加等有关，其最终导致的结果为心肌细胞凋亡〔1〕。还有研究显示，当心肌细胞受到外部刺激时，心肌细胞激发内质网应激，而内质网应激的UPR首先被活化的是PERK信号转导通路。PERK有两个底物eIF2a和Nrf2〔2〕。PERK可以磷酸化Nrf2后，其与胞质内的抑制剂Keap1分离，引起Nrf2移位至细胞核内，诱导抗氧化应激应答的基因表达等〔3〕。在心肺复苏中肾上腺素被广泛使用，但是在2010年国际心肺复苏和心血管急救指南及治疗建议中引入血管加压素，替代首剂量或第二剂量的肾上腺素。现有的研究认为血管加压素能提高患者生存率〔4〕，但是其作用机制还不确定。本研究拟观察血管加压素对心搏骤停大鼠心肌细胞中内质网应激PERK-Nrf2通路的作用。

1 材料与方法

1.1 药品及主要试剂 肾上腺素(天津遂成药业)，血管加压素和谷胱甘肽检测试剂盒(美国 Sigma公司)，GRP78、PERK和Nrf2抗体(北京博奥森生物科技有限公司)。

1.2 实验动物造模及分组 健康Wistar大鼠50只，体重(250±10)g，雌雄各半，由吉林大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK-(吉)2008-0005。本研究采用窒息导致心搏骤停模型。造模前给予禁食不禁水12 h，给予10%水合氯醛进腹腔麻醉后。给予手术区域剃毛，随后用医用碘伏消毒。用眼剪沿颈部正中用剪开颈部皮肤，分离各肌层暴露气管，气管切开，建立有效气道。随后暴露右侧腹股沟区，股静脉置管，用于给药。待生命体征平稳后，夹住气管导管，待大鼠发生呼吸心搏骤停且平均动脉压≤25 mmHg时，为成功造模。随机分为心搏骤停组(CA组)、肾上腺素治疗组(EPI组)、血管加压素治疗组(Vp组)和血管加压素联合肾上腺素治疗组(Epi+Vp组)各10例。CA组给予心肺复苏和1 ml生理盐水静脉注射，待大鼠呼吸心跳停止留取血标本和心脏组织。Epi组给予心肺复苏和0.2 mg/kg的肾上腺素静脉注射。Vp组给予心肺复苏和0.8 U/kg的血管加压素静脉注射。血管加压素联合肾上腺素治疗组给予心肺复苏同时0.2 mg/kg肾上腺素+0.8 U/kg血管加压素静注入。肾上腺素、血管加压素和联合用药组心搏骤停复苏成功1 h后留取尾静脉血和留取大鼠心肌组织。蛋白质免疫印迹检测肺组织GRP78、PERK和Nrf2蛋白的表达。

1.3 血清学检测 采用Sigma公司谷胱甘肽检测试剂盒，具体试验步骤按照试剂盒说明书。计算出(GSH)/(GSSG)比值，为血清中抗氧化水平。

1.4 统计学分析 蛋白条带用Image J图像处理软件计算各条豆类灰度值。各组间差异进行ANOVA分析。

2 结 果

2.1 心搏骤停大鼠血清中GSH/GSSG值变化 与CA组(0.96±0.11)相比，Epi组(2.56±1.13)、Vp组(2.64±1.16)和Epi+Vp组(3.96±1.23)GSH/GSSG值明显增加(P<0.01)。

2.2 Western印迹法检测心搏骤停大鼠心肌组织中GRP78、PERK和Nrf2蛋白的表达 与CA组相比，Epi组、Vp组和Epi+Vp组中的心肌组织中GRP78蛋白的表达明显增加(P<0.01)。与CA组相比，Epi组和Vp组中的PERK和Nrf2蛋白增加(P<0.05)，Epi+Vp组PERK和Nrf2蛋白明显增加(P<0.01)。与Epi组和Vp组相比，Epi+Vp组中的PERK和Nrf2蛋白明显表达增加(P<0.05)，见图1。

图1 心搏骤停大鼠心肌组织中相关蛋白的表达

3 讨 论

目前，出现器质性和生理性的心搏骤停的病人逐渐增多，但是心脏临床医疗中针对抢救心搏骤停的药物主要以肾上腺素为主，肾上腺素主要是激动周围血管的α1受体，收缩周围的血管从而提高主动脉舒张压，增加脑的灌注压及冠状动脉压，兴奋β受体，提高心率，增加心肌收缩力。但是研究证实肾上腺素可引起复苏后伴随着严重心律失常和心功能不全〔5〕，2010年国际心肺复苏和心血管急救指南及治疗建议中引入血管加压素，血管加压素主要通过受体发挥作用，认为其可以增加重要脏器的血流量，来减少缺血再灌注引起的损伤。同时还发现其不仅能够提高冠脉灌注压，还能够增加左室心肌及脑血管等重要脏器的血流量〔6〕。之前一些研究发现了肾上腺素联合血管加压素能改变心肌组织中PI3K/Akt信号通路〔7〕。本研究结果说明在复苏后大鼠血清的抗氧化水平增加。而且在心搏骤停后，给予心肺复苏和药物治疗后，内质网应激程度增加。研究发现心肌细胞受到外部刺激时，心肌细胞激发内质网应激。内质网应激的UPR反应首先被活化的是PERK信号转导通路，PERK有两个底物eIF2a和Nrf2〔2〕。PERK可以磷酸化Nrf2后，其与胞质内的抑制剂Keap1分离，引起Nrf2移位至细胞核内，诱导抗氧化应激应答的基因表达等〔3〕。本研究结果这说明在心搏骤停后，给予心肺复苏和Epi+Vp治疗后，引起内质网应激增加，诱导PERK-Nrf2通路的活化，增加细胞内抗氧化酶的表达。也说明在血清中检测还原型谷胱甘肽的表达增加可能是由于PERK-Nrf2通路的活化引起的。

1 Bagheri F,Khori V,Alizadeh AM,etal.Reactive oxygen species-mediated cardiac-reperfusion injury:mechanisms and therapies〔J〕.Life Sci,2016;15(1):43-55.

2 Harding HP,Zhang Y,Zeng H,etal.An integrated stress response regulates amino-acid metabolism and resistance to oxida-tive stress〔J〕.Mol Cell,2003;11(3):619-33.

3 Cullinan SB,Diehl JA.Coordination of ER and oxidative stress signaling:the PERK/Nrf2 signaling pathway〔J〕.Int J Biochem Cell Biol,2006;38(3):317-32.

4 Hazinski MF，Nolan JP，Billi JE，etal.Part 1：Executive summary：2010 international consensus on cardiopulmonary resuscitation and emergency cardiovascular care science with treatment recommendations〔J〕.Circulation，2010;122(16 suppl 2)：S250-75.

5 Ghafourian N,Maniae NH,Taherikalani M,etal.Combination of vasopressin-epinephrine as a novel candidate in patients with cardiac arrest〔J〕.Recent Adv Cardiovasc Drug Discov,2015;10(1):65-9.

6 Babar SI，Berg RA，Hilwig RW，etal.Vasopressin versus epinephrine during cardiopulmonary resuscitation：a randomized swine outcome study〔J〕.Resuscitation,1999;41(2):185-92.

7 岳菁菁.血管加压素联合肾上腺素对心搏骤停大鼠复苏后心肌损伤PI3k/Akt信号通路的作用及影响〔D〕.长春：吉林大学，2011.

〔2017-04-11修回〕

(编辑 李相军)

吉林省卫生计生委项目(2015SZC13)

刘月英(1977-)，女，副主任医师，主要从事重症医学研究。

R331.3

A

1005-9202(2017)14-3397-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.007

1 吉林大学中日联谊医院