Bt Cry8Ea蛋白对华北大黑鳃金龟幼虫（Holotrichia oblita）中肠微生物菌群的影响

王伟赵丹郭巍，2李新娜张雅昆闫晓平

（1. 河北农业大学植物保护学院 河北省农作物病虫害生物防治工程技术中心，保定 071001；2. 北京农学院植物科学技术学院，北京 102206；3. 邢台市农业科学研究院，邢台 054000）

Bt Cry8Ea蛋白对华北大黑鳃金龟幼虫（Holotrichia oblita）中肠微生物菌群的影响

王伟1赵丹1郭巍1，2李新娜3张雅昆1闫晓平1

（1. 河北农业大学植物保护学院 河北省农作物病虫害生物防治工程技术中心，保定 071001；2. 北京农学院植物科学技术学院，北京 102206；3. 邢台市农业科学研究院，邢台 054000）

Bt Cry8Ea蛋白对华北大黑鳃金龟幼虫有特异的杀虫活性，通过中肠微生物宏基因组分析研究了Bt Cry8Ea蛋白与华北大黑鳃金龟幼虫中肠微生物的相互作用。解剖正常饲喂和饲喂Cry8Ea蛋白的华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita二龄幼虫中肠，提取中肠微生物宏基因组DNA，构建16S rDNA文库。利用PCR-RFLP 方法分析两个处理中肠微生物16S rDNA酶切片段多态性（MspⅠ，RsaⅠ和Hae Ⅲ内切酶），不同克隆测序后与NCBI数据库进行对比分析，构建系统进化树，确定中肠微生物种属。结果显示，正常饲喂的华北大黑鳃金龟幼虫中肠微生物共检出30种细菌，优势菌群为变形菌门（Proteobacteria）：（Desulfosporosinus，29.63%）；厚壁菌门（Firmicutes）：梭菌属（Clostridium，12.59%）和芽孢杆菌属（Bacillus，10.37%），而饲喂Cry8Ea蛋白的华北大黑鳃幼虫中共检出4种细菌，优势菌群为厚壁菌门（Firmicutes）：肠球菌属（Enterococcus，50%）和链球菌属（Streptococcus，46.88%）。结果表明，饲喂Cry8Ea蛋白后，中肠微生物的菌群结构发生了明显变化。

华北大黑鳃金龟；中肠微生物；Bt Cry8Ea蛋白；PCR-RFLP

昆虫中肠内丰富的营养物质以及独特的理化环境为微生物的生长与繁殖提供了便利条件，其中大部分正常菌群对宿主无害，统称为有益菌群［1］。正常情况下有益菌群处于动态平衡中，可通过合成多种消化酶参与昆虫体内的消化过程，协助降解有毒物质［2］，提高昆虫防御能力［3］，进而维持虫体的正常生理机能。昆虫中肠内有益菌群的动态平衡一旦被打破，会对昆虫的生理生化机能乃至生长发育产生一定的影响。

昆虫肠道微生物包括细菌、真菌、原生动物和古生菌，其中细菌所占比例较高，为主要菌群。不同昆虫，不同发育阶段中肠内的微生物总量和优势菌群也不同。黄胜威等［4］发现暗黑鳃金龟（Holotrichia parallela ）幼虫中肠微生物主要以厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、放线菌门和梭杆菌门细菌为主，其中厚壁菌门和变形菌门菌群最多。张珏峰［1］发现二化螟（Chilo suppressalis）中肠细菌群落的组成及丰富度随着虫体抗药性的不同存在明显差异；王尧等［5］发现黄粉虫肠道菌群在黄粉虫蛋白质消化过程中发挥一定的作用。

华北大黑鳃金龟（Holotrichia oblita）属鞘翅目，鳃金龟科，幼虫又名蛴螬，是重要的地下害虫。苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）可分泌具有杀虫活性的杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal proteins，ICPs）和多种营养期杀虫蛋白（Vegetative insecticidal protein，VIP），对包括蛴螬在内的多种昆虫具有杀虫活性［6，7］。昆虫中肠是消化食物的主要场所，也是Bt杀虫蛋白的靶标部位，不同昆虫饲喂Bt杀虫蛋白后对昆虫肠道细菌的影响各不相同。饲喂商业型B. thuringiensis subspecies kurstaki（DiPel DF），发现该Bt菌株对舞毒蛾（Porthetria dispar）幼虫的毒杀作用依赖于中肠微生物Enterobacter sp，饲喂舞毒蛾抗生素降低肠杆菌浓度后，Bt的杀虫活性降低［8］。与此相类似，饲喂鳞翅目小红蛱蝶（Vanessa cardui），烟草天蛾（Manduca sexta），菜粉蝶（Pieris rapae）抗生素后，改变了虫体内中肠微生物的结构组成，降低了虫体对Bt杀虫蛋白的敏感性［9］。同时研究，分别饲喂二化螟幼虫Bt杀虫蛋白Cry1Ab、Cry1Ab和Cry1Ca后，相对于对照组，幼虫的中肠微生物菌群的丰富度发生改变，优势菌群比重也发生改变［10］。由此可见，虫体内中肠微生物种群结构变化在Bt蛋白的杀虫机理中发挥重要作用。Cry8Ea对华北大黑鳃金龟幼虫有特异杀虫活性，LC50为0.267 9 μg/mL［11］，本研究通过比较正常饲喂和饲喂Cry8Ea蛋白的华北大黑鳃金龟二龄幼虫中肠微生物菌群变化，揭示Cry8Ea蛋白对微生物菌群的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试昆虫 于河北省保定地区采集华北大黑鳃金龟，放入装有细土的培养箱（长50 cm，宽37 cm，高22.5 cm）中，并保持箱中细土的湿度，野外采集的榆树叶室内饲养。每日观察，至成虫发生交尾后，每周一次翻土，将初孵幼虫取出放入装有细土的小盒中（每盒10-15头）培养至二龄，分装至24孔板中饲养，避免蛴螬自相残杀。幼虫分出后即可饲喂新鲜的土豆块。

1.1.2 主要试剂 DNA抽提缓冲液：1.5 mol/L NaCl，100 mmol/L磷酸盐缓冲液，100 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris-HCL；10 mg/mL蛋白酶K（BOSTER）；1 mol/L IPTG、20 mg/mL X-gal和100 mg/mL 氨苄青霉素；DNA纯化试剂盒（TIANGEN）；pGEM-T Easy载体（Promega）；限制性内切酶：MspⅠ，RsaⅠ和Hae Ⅲ（Promega）。

1.2 方法

1.2.1 中肠的提取与分离 将正常饲喂与饲喂Cry8Ea蛋白的华北大黑鳃金龟二龄幼虫分别用无菌水漂洗30 s，晾干后用75%酒精擦拭清洁幼虫体表，75%酒精体表消毒2 min，再用无菌水漂洗以彻底去除残留体表的酒精。在无菌条件下，用已消毒的剪刀从两侧剪开幼虫虫体，取出中肠，放入1.5 mL的EP管中。

1.2.2 DNA的提取和16S rDNA片段的扩增 肠道微生物总DNA的提取参照黄胜威采用的方法［4］。以提取的中肠微生物总DNA为模板，用细菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），1492R（5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）进行PCR扩增。PCR反应体系为：模板DNA 2 μL，10×Reaction Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，10 μmol/L 27F 0.5 μL，10 μmol/L1492R 0.5 μL，Taq polymerase 0.2 μL。PCR反应程序为：94℃预变性5 min，94℃变性50 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min 20 s，30个循环。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，DNA纯化试剂盒纯化回收。

1.2.3 16S rDNA文库的构建 将纯化的PCR产物连接至pGEM-T Easy载体（Promega）中，构建华北大黑鳃金龟中肠细菌16S rDNA文库。连接产物转化至TG1感受态中，在含有IPTG、X-Gal和氨苄青霉素的LB平板上37℃培养过夜。挑取白色菌落，用通用引物T7（5′-TAATACGACTCACTATAGGG -3′），SP6（5′-ATTTAGGTGACACTATA-3′） 进 行PCR扩增鉴定。PCR反应体系为：模板DNA 2 μL，10×Reaction Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，10 μmol/L T7 0.5 μL，10 μmol/L SP6 0.5 μL，Taq polymerase 0.2 μL。PCR反应程序为：94℃预变性3 min，94℃变性40 s，57℃退火40 s，72℃延伸1 min 10 s，30个循环。

1.2.4 PCR-RFLP 对阳性克隆所携带的16S rDNA进行PCR扩增后分别用3种限制性酶Msp I，Rsa I和Hae III酶进行限制性酶切消化（37℃，3 h），用2%的琼脂糖凝胶电泳分析酶切片段多态性。根据Msp I，Rsa I和Hae III 3种酶切基因片段多态图谱为基础进行分类。

1.2.5 测序及序列分析 根据酶切图谱将阳性克隆送去上海生工生物技术有限公司进行测序。将测序结果通过NCBI GenBank 数据库进行blast 比对分析，利用clustalx1.83和MEGA6.06软件构建系统进化树。

2 结果

2.1 华北大黑鳃金龟幼虫中肠微生物总DNA的提取及16S rDNA的PCR扩增

提取正常饲喂与饲喂Cry8Ea蛋白的华北大黑鳃金龟二龄幼虫中肠微生物的基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳结果（图1）显示所提取的基因组DNA条带完整性好，特异度高。分别以两个处理的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到约1 500 bp大小的目的条带（图2），与预期结果相符，进行后续实验。

2.2 16S rDNA的PCR-RFLP分析

将正常饲喂组与饲喂蛋白组酶切图谱中呈现不同带型的阳性克隆送去测序（图3，图4）。其中正常饲喂组测序150个，饲喂蛋白组测序50个。结果表明正常饲喂组华北大黑鳃金龟幼虫中肠微生物种群含有30种细菌。系统进化树显示（图5），分别属于5种细菌门：变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）和梭杆菌门（Fusobacteria），优势细菌菌群为变形菌门的Desulfosporosinus（29.63%），厚壁菌门的梭菌属（Clostridium，12.59%）和芽胞杆菌属（Bacillus，10.37%）（表1）。饲喂蛋白组华北大黑鳃金龟幼虫中肠微生物中共检测出4种细菌（表2），其中优势菌群为肠球菌属（Enterococcus）、链球菌属（Streptococcus）。

图1 中肠微生物基因组DNA

图2 16S rDNA的PCR扩增结果

3 讨论

华北大黑鳃金龟幼虫（蛴螬）属于土栖性地下害虫，体型较大，生活隐蔽，抗药性强，化学防治比较困难，农药的大量使用严重污染环境。因此，寻找新的蛴螬防治方法十分必要。近年来生物防治因其特异性好、安全性高，受到人们的重视。Bt杀虫蛋白的作用范围较广，包括鳞翅目的天蚕蛾［12］、家蚕［13］，直翅目的东亚飞蝗［14］，蜚蠊目的东方蜚蠊［15］。对Bt杀虫蛋白作用机制的研究：一方面认为可溶性晶体蛋白经中肠蛋白酶活化后与中肠上皮细胞受体结合，破坏细胞膜的完整性，最终导致虫体死亡［16］；另有研究表明，中肠微生物Enterobacter sp 在Bt杀虫蛋白对舞毒蛾幼虫的毒杀作用中发挥着至关重要的作用，而且这种现象也存在于其他鳞翅目小红蛱蝶，烟草天蛾，菜粉蝶［8，9］。

图3 正常饲喂组16S rDNA阳性克隆Msp I（A），Rsa I（B）和Hae III（C）部分酶切图谱

图4 饲喂Cry8Ea组16S rDNA阳性克隆Msp I（A），Hae III（B）和Rsa I（C）部分酶切图谱

昆虫中肠是消化食物的主要场所，也是Bt杀虫蛋白的靶标部位，不同种类、不同时期、不同地区昆虫中肠内微生物菌群结构组成差异较大［17，18］。有研究表明橘小实蝇 Bactrocera dorsalis 中与免疫调控有关的PGRP-LB 和 PGRP-SB基因的缺失会影响虫体中肠微生物菌落的结构与组成［19］。由此可见，中肠微生物的多样性以及丰富度与昆虫的生长发育密切相关。本实验利用16S rDNA PCR-RFLP的方法对饲喂Cry8Ea毒素蛋白后，华北大黑鳃金龟二龄幼虫中肠微生物菌群的组成和多样性进行分析结果显示，正常饲喂组华北大黑鳃金龟幼虫中肠微生物种群由30种细菌组成，优势菌群为变形菌门：（Desulfosporosinus，29.63%）；厚壁菌门：梭菌属（Clostridium，12.59%）和芽孢杆菌属（Bacillus，10.37%）；而饲喂杀虫蛋白后幼虫中肠微生物种类明显减少，共检测出4种细菌；优势菌群变为厚壁菌门：肠球菌属（Enterococcus）和链球菌属（Streptococcus），菌群比例也发生变化分别上升为50%与46.88%。有研究将Bt杀虫蛋白饲喂二化螟幼虫，解剖中肠检测其微生物结构组成，发现二化螟幼虫中肠细菌群落结构发生明显变化［10］，与本实验结果相似。推测中肠微生物菌群的改变是由于饲喂Bt杀虫蛋白后对中肠内的pH值，离子环境等产生影响，从而改变了中肠微生物的生境，破坏了原有微生物菌群的动态平衡所致，但Bt蛋白杀虫活性的发挥是否依赖于特定的关键中肠微生物，有待进一步的研究。

图5 基于16S rDNA序列的正常饲喂的华北大黑鳃金龟幼虫中肠微生物系统发育树

表1 正常饲喂组华北大黑鳃金龟幼虫中肠细菌种类

表2 饲喂Cry8Ea蛋白华北大黑鳃金龟幼虫中肠细菌种类

4 结论

正常饲喂和饲喂Cry8Ea蛋白华北大黑鳃金龟二龄幼虫中肠微生物菌群结构发生明显变化，中肠微生物菌群的多样性和丰度都有很大的差异性。

［1］ 张珏峰, 何月平, 陈建明. 不同抗药性水平二化螟幼虫中肠细菌群落多样性分析［J］. 昆虫学报, 2013, 56（9）：1075-1082.

［2］ Babendreier D, Joller D, Romeis J, et al. Bacterial community structures in honeybee intestines and their response to two insecticidal proteins［J］. FEMS Microbiology Ecology, 2007, 59（3）：600-610.

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［5］ 王尧. 黄粉虫幼虫肠道细菌在其蛋白质消化利用中的作用研究［D］. 杨凌：西北农林科技大学, 2015.

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（责任编辑 李楠）

Effects of Bt Cry8Ea Protein on the Midgut Microbial Flora of Holotrichia oblita Larvae

WANG Wei1ZHAO Dan1GUO Wei1，2LI Xin-na3ZHANG Ya-kun1YAN Xiao-ping1
（1. College of Plant Protection，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001；2. College of Plant Science and Technology，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206；3. Xingtai Academy of Agricultural Sciences，Xingtai 054000）

Bt Cry8Ea protein presents insecticidal activity to Holotrichia oblita larvae. The interaction between Bt Cry8Ea protein and the midgut microorganism in H. oblita larvae was investigated by metagenome DNA analysis. The midguts in normal-fed or Cry8Ea protein-fed H. oblita（2nd-instar larva）were collected and then used to extract metagenome DNAs of midgut microorganism for constructing 16S rDNA gene libraries. Polymerase chain reaction restriction fragment polymorphism（PCR-RFLP）was employed to determine the polymorphisms of 16S rDNA enzyme-spliced fragments（Msp I，Rsa I，and Hae III restriction enzyme）from the midgut microorganism of two fed larvae. Different types of clones were sequenced and then aligned with NCBI gene database，and the phylogenetic tree was constructed to study the differences of microbial communities. The results showed that there were 30 bacteria in the normal group of H. oblita，and the predominant bacteria were Desulfosporosinus（29.63%），Clostridium（12.59%），and Bacillus（10.37%）respectively. However，there were only 4 bacteria in the Cry8Ea protein-fed H. oblita group，and the predominant bacteria were Enterococcus（50%）and Streptococcus（46.88%）. These data revealed that the treatment with Cry8Ea protein changed the abundance and composition of midgut microbial flora.

Holotrichia oblita；midgut microorganism；Bt Cry8Ea protein；PCR-RFLP

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0236

2017-03-25

国家现代农业产业技术体系项目（CARS-14）

王伟，男，博士研究生，研究方向：生防微生物与基因工程；E-mail：wwjiayou85@126.com

郭巍，女，博士，研究方向：有害生物控制与分子机理；E-mail：1787421502@qq.com