人参皂苷酶Ⅲ型转化人参皂苷Rc制备稀有皂苷C-Mc

李 冠 亨， 刘 春 莹， 徐 龙 权， 林 完 泽， 鱼 红 闪

( 1.大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116034；2.韩京国立大学 生命科学学院, 京畿道 安城 456-749 )

人参皂苷酶Ⅲ型转化人参皂苷Rc制备稀有皂苷C-Mc

李 冠 亨1， 刘 春 莹1， 徐 龙 权1， 林 完 泽2， 鱼 红 闪1

( 1.大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116034；2.韩京国立大学 生命科学学院, 京畿道 安城 456-749 )

利用基因构建克隆的E.coliC41菌产人参皂苷酶Ⅲ型，研究了酶转化人参皂苷Rc制备高活性稀有皂苷C-Mc的方法。结果发现，人参皂苷酶Ⅲ型先水解人参皂苷Rc的3-O-末端葡萄糖基生成C-Mc1，再水解C-Mc1的3-O-葡萄糖基生成C-Mc。人参皂苷酶Ⅲ型水解4.8 g的人参皂苷Rc，得到2.8 g 产物，经HPLC检测，其纯度为90%。经核磁共振检测，产物结构为20-O-α-L-阿拉伯呋喃糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖基-20(S)-二醇苷元，即C-Mc。

稀有人参皂苷；人参皂苷酶Ⅲ型；高效液相色谱；核磁共振

0 引 言

生晒参和西洋参中80%～90%的皂苷为Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1，这些人参皂苷在人体内吸收率低、活性低[1-3]；而人参稀有皂苷C-K、Rh2、C-Mc等更容易被吸收，具有抗疲劳、抗癌等生理功能[4-6]。但是，生晒参中几乎不含人参稀有皂苷。因此，将人参中含量高的皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1生物转化制备成高活性的C-K、Rh2、C-Mc等人参稀有皂苷，对人参产业、新药开发、保健食品和化妆品等具有重大意义[7-8]。

人参皂苷的转化方法主要有化学法和酶法，这两种方法都能使人参皂苷转化成高活性的稀有皂苷。通过化学法转化的人参皂苷具有目的性差、产物庞杂、污染严重、难于下游分离纯化等劣势。酶法水解人参皂苷具有很多的优点，反应条件温和，在常温下即可反应，反应过程容易控制；有很强的底物专一性，产物单一，对环境没有污染。李永淳等[9]用硅胶柱层析法，对前期采用生物酶转化法制备并经脱糖脱色处理过的粗品人参皂苷进行了分离纯化，得到了纯度为82.2%的C-Mc。

为了酶转化得到高活性人参稀有皂苷，本实验室相继报道了4种特异的人参皂苷糖苷酶：人参皂苷糖苷酶Ⅰ型，能水解人参二醇类皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rd的第3(C)-O-和20(C)-O-多种糖基[10]；人参皂苷酶Ⅱ型，能水解原人参二醇类皂苷的20-O-多种糖基[11]；人参皂苷酶Ⅲ型，能水解原人参三醇类皂苷3-O-多种糖基[12]。本实验室与韩国林完泽教授合作研究，将新发现的Terrabacterginsenosidimutansgsoil 3082T菌种中的人参糖苷酶基因(bgl-gyp17)，克隆到E.coliC41(DE3)中表达，得到人参皂苷酶Ⅲ型，该酶能水解人参二醇类皂苷Rb1、Rb2、Rc的3-O-多种糖基[13]。

本实验利用已克隆表达的人参皂苷酶Ⅲ型，研究酶转化人参皂苷Rc制备高活性稀有皂苷C-Mc的方法，对酶转化产物进行分离纯化，并进行核磁共振结构鉴定。

1 材料与方法

1.1 材 料

人参皂苷Rc，本实验室提供；产人参皂苷酶Ⅲ型的基因工程菌，本实验室人员与林完泽教授共同构建；薄层层析板Silica gel 60-F254，德国Merck公司；大孔树脂AB-8，南开大学化工厂。

1.2 方 法

1.2.1 酶转化Rc制备高活性人参稀有皂苷C-Mc

将4.8 g人参皂苷Rc溶解在200 mL的酶液中，在40 ℃摇床反应2～24 h，用TLC检测反应程度，具体过程按参考文献[14]进行。

1.2.2 薄层层析法(TLC)检测转化率

展开剂配比为体积比为7∶3∶0.5的氯仿-甲醇-水溶液，10%硫酸加热显色。用BandScan软件分析Rc转化成C-Mc1和C-Mc的转化率[15]。

1.2.3 高效液相色谱法(HPLC)检测纯度

色谱仪，Waters 2695高效液相色谱分析仪、Waters 2996二极管阵列检测器及Empower色谱工作站进行检测。Knauer C18色谱柱(5 μm, 250 mm×3 mm)；流动相：乙腈(A)-水(B)，0～20 min，20%A等度；20～31 min，20%～32%A线性梯度；31～40 min，32%～43%A线性梯度；40～70 min，43%～100%A线性梯度。进样量10 μL，柱温35 ℃，体积流量0.6 mL/min，检测波长203 nm。

1.2.4 核磁共振分析产物结构

使用瑞士Bruke AVANCE 600超导核磁共振波谱仪，对单体皂苷进行核磁共振检测，包括一维1H、13C、DEPT谱，二维HSQC、HMBC、COSY谱检测。1H检测频率为600 MHz，13C检测频率为150 MHz，使用5 mm NMR探头，实验温度25 ℃，湿度40%，溶剂Pyridine-D5，氢谱和碳谱均以Pyridine-D5为内标。

2 结果与讨论

2.1 人参皂苷Rc的酶转化及酶反应条件的优化

2.1.1 反应pH

以人参皂苷Rc为底物，分别在pH 2～10条件下反应8 h，TLC检测相对酶活力，结果如图1所示。由图1可知，人参皂苷酶Ⅲ型酶的最适pH为6。

图1 不同pH下的酶活力

2.1.2 反应温度

以人参皂苷Rc为底物，在pH=6条件下，分别在不同温度下反应8 h，TLC检测相对酶活力，结果如图2所示。由图2可知，人参皂苷酶Ⅲ型酶的最适反应温度为40 ℃。

图2 不同温度下的酶活力

2.1.3 底物质量分数

分别配制不同质量分数的人参皂苷Rc，在pH 6和40 ℃条件下反应8 h，TLC检测产物得率，结果如图3所示。由图3可知，底物质量分数为2%时产物得率最大。

图3 不同底物质量分数下的产物得率

2.1.4 反应时间

在pH 6、反应温度为40 ℃，底物质量分数2%的条件下，每4 h取样一次，TLC检测，计算人参皂苷C-Mc的得率，结果如图4所示。由图4可知，反应时间为24 h时C-Mc的得率最大。

图4 不同时间下的产物得率曲线

2.2 人参皂苷Rc到C-Mc的酶转化过程

将25 mL酶液放入250 mL三角瓶中，再加入0.5 g人参皂苷Rc溶解，在最适反应条件下，反应2、3、10、20 h，各取样0.2 mL，加入0.2 mL水饱和正丁醇终止反应，TLC结果如图5所示。

Rc，反应底物；1、2、3、4，反应2、3、10、20 h的产物；C-Mc、C-Mc1，混合的标准品

图5 人参皂苷Rc不同酶反应时间的TLC结果

Fig.5 TLC result of enzyme reaction of ginsenoside Rc at different time

从图5中可以看到，人参皂苷Rc酶反应2 h时，40%～45%的Rc转化为C-Mc1；反应3 h时，80%以上的Rc转化为C-Mc1，同时有少量C-Mc产生；酶反应10 h时，几乎全部的Rc转化为C-Mc1 和C-Mc，其比例约35∶65；酶反应20 h时，95%以上的产物为C-Mc，C-Mc1含量很低。

由此可见，人参皂苷酶Ⅲ型，首先水解人参皂苷Rc的3-O-末端葡萄糖基生成C-Mc1，反应速度较快；再水解C-Mc1的3-O-葡萄糖基生成C-Mc，反应速度相对慢。由此可以得到酶转化人参皂苷Rc的反应方式，如图6所示。

2.3 人参皂苷Rc的酶转化制备稀有皂苷C-Mc

由图5可知，酶反应20 h时，Rc的主要产物是C-Mc，因此反应24 h，主要反应产物是人参稀有皂苷C-Mc。按“1.2.2”的方法，4.8 g的人参皂苷Rc经酶转化，并经AB-8大孔吸附树脂纯化处理得到2.8 g的C-Mc，产物得率达58%。

图6 人参皂苷酶Ⅲ型水解人参皂苷Rc的反应式

纯化得到的C-Mc，采用HPLC进行纯度检测。以人参皂苷Rc为标准品，采用“1.2.4”的方法，以峰面积为y轴，底物质量分数为x轴，得到标准方程为y=3×106x-16 915(R2=0.999 6)。采用相同的检测条件，对纯化得到的C-Mc进行HPLC测定，结果如图7所示。将峰面积带入方程，计算得到产物C-Mc的纯度为90%。

2.4 酶转化产物C-Mc的结构鉴定

取200 mg纯度为90%的酶转化产物，用MeOH-H2O体系结晶重结晶得到C-Mc单晶，然后作核磁共振分析。结果与参考文献[12]比对，发现产物的化学位移与文献中C-Mc的化学位移相似，因此可以确定其化学结构。酶转化产物C-Mc 核磁共振13C检测结果如表1所示。

图7 产物人参稀有皂苷C-Mc的HPLC图

表1 人参稀有皂苷C-Mc的 13C NMR化学位移和结构归属

3 结 论

利用本实验室构建的基因工程菌，对其产人参皂苷酶Ⅲ型，确定了最佳酶反应条件：pH 6，反应温度40 ℃，最佳底物质量分数2%，最佳反应时间24 h。对人参皂苷酶Ⅲ型的酶反应过程研究表明，该酶的反应产物C-Mc是分两步催化反应产生的，第一步催化水解人参皂苷Rc的3-O-末端葡萄糖基生成C-Mc1，第二步再水解C-Mc1的3-O-葡萄糖基生成C-Mc。4.8 g人参皂苷Rc通过人参皂苷酶Ⅲ型转化，经AB-8树脂吸附处理得到C-Mc 2.8 g，产物得率达58%，HPLC纯度达90%。产物经核磁共振检测，确定结构为20-O-α-L- 阿拉伯呋喃糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖基-20(S)-二醇苷元，即C-Mc。

在酶转化制备C-Mc的研究中，采用AB-8树脂进行纯化处理，得到产物纯度达90%，操作快捷简单，无污染，适于工业化生产。

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Preparation of minor ginsenoside C-Mc from ginsenoside Rc using special ginsenosidase type-Ⅲ

LI Guanheng1, LIU Chunying1, XU Longquan1, LIN Wanze2, YU Hongshan1

( 1.School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2.School of Life Science, Hankyong National University, Anseong 456-749, Korea )

To study the enzymatic conversion from ginsenoside Rc to the rare ginsenoside C-Mc with high active, the ginsenosidase Ⅲ was expressed from recombinantEscherichiacoliC41 and its enzymatic transformation processes were explored. The 3-O-glucopyranoside end of ginsenoside Rc was hydrolyzed to C-Mc1 by ginsenosidase Ⅲ, then C-Mc1 was transformed to C-Mc. 4.8 g ginsenoside Rc was hydrolyzed to 2.8 g products by ginsenosidase Ⅲ, of which purity could reach to 90% determined by HPLC. The result of NMR showed that its structure was 20-O-[α-L-arabinofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl]-20(S)-protopanaxadiol, that was C-Mc.

rare ginsenoside; ginsenosidase Ⅲ; HPLC; NMR

2015-12-09.

“重大新药创制”科技重大专项(2012ZX09503001-003)；国家高端外国专家项目(GDT20152100019).

李冠亨(1992-)，男，硕士研究生；通信作者：鱼红闪(1968-)，男，教授.

TS201.2；Q946.83

A

1674-1404(2017)04-0250-05

李冠亨,刘春莹,徐龙权,林完泽,鱼红闪.人参皂苷酶Ⅲ型转化人参皂苷Rc制备稀有皂苷C-Mc[J].大连工业大学学报,2017,36(4):250-254.

LI Guanheng, LIU Chunying, XU Longquan, LIN Wanze, YU Hongshan. Preparation of minor ginsenoside C-Mc from ginsenoside Rc using special ginsenosidase type-Ⅲ[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(4): 250-254.