几种马铃薯耐冻性分析方法比较

丁 旭，潘 妃，谢 洁，王 明，李 青，秦玉芝

（湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128）

几种马铃薯耐冻性分析方法比较

丁 旭，潘 妃，谢 洁，王 明，李 青，秦玉芝

（湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128）

将费乌瑞它、兴佳二号、金山薯、紫2作为试验材料，取成熟的顶端功能叶片进行低温梯度处理，分别进行电导率、过氧化氢DAB原位检测、丙二醛和可溶性糖含量分析，综合得出与耐寒表型相关性好、重复性高、方便操作的分析方法。结果表明：电导法简单便于操作，技术要求低，试验结果可以直观准确地表明各品种耐冻性强弱，缺点是电解质外渗率的测定受环境温度影响大，数据重复性较低；丙二醛及可溶性糖含量的测定所需仪器、人员等均要求低，可操作性强，其缺点是操作过程较繁杂，重复性较低，且数据分析过程相对较难；DAB组织定位法所需仪器、人员要求极低，操作简单，人工时间成本低，得到结果速度快，表型特征明显，易于识别与比较不同品种的耐冻性的大小，同时重复性强，干扰因素小，更方便用于耐冻性研究。

电解质渗出率；半致死温度；丙二醛含量；可溶性糖含量；过氧化氢；DAB染色

目前，在测定植物耐冻性的方法中尤其突出且广泛认可的一种是相对电导率的测定，并拟合Logistic方程计算出半致死温度进行比较。徐伟等[1]以火焰无核、红宝石无核2个葡萄品种的一年生休眠枝条为试验材料，通过测定其电解质渗出率，得到了这2个品种的耐冻性大小的结论，并指出伴随着低温胁迫，各品种葡萄枝条的电解质渗出率升高。巩慧玲等[2]应用电导率法拟合Logistic方程对二倍体材料、它们的杂交后代及四倍体材料进行耐冻性的差异比较，得到二倍体材料H28-7的半致死温度最高，耐冻性最弱。另一种方法是丙二醛（MDA）、可溶性糖含量的测定。林艳等[3]对大叶女贞不同品种单株的叶片进行低温处理，以MDA、可溶性糖的含量作为反映耐冻性的生理指标，结果表明幼苗叶片MDA、可溶性糖含量随处理时间延长逐渐上升；耐冻性弱的普通树MDA、可溶性糖整体含量显著高于耐冻性强的优质树。此外，苗雨晨等[4]用ABA处理蚕豆叶片下表皮，发现ABA在诱导蚕豆气孔关闭过程中，气孔保卫细胞产生了H2O2。因此，过氧化氢这种敏感的信号分子是否可以作为研究耐冻性的信号分子，非常值得探究。

1 材料与方法

1.1 试验地点及供试材料

试验于2015～2016年在湖南农业大学园艺园林学院基地和实验室展开。以费乌瑞它、兴佳二号、金山薯、紫2作为试验材料。植物种植在盆中放置在屋顶生长，小粒种子一个盆中放一粒，大粒种子将块茎进行切割处理，取适当大小种植在盆中。生长2个月左右，进行试验。

1.2 试验方法

1.2.1 取样方法与低温梯度处理 （1）取样方法。参照李飞等[5]的方法，根据试验所需进行略微调整，进行材料低温梯度处理。取叶片样品时，同一生理指标选择不同植株相同部位，取长势一致完全伸展的、充分成熟的顶端功能叶片，连带叶柄取下，用蒸馏水反复冲洗并吸干叶片表面水分。（2）低温梯度处理。将叶片放入50 mL离心管中，封口；将离心管放入低温循环水浴锅中，水浴锅初始温度设为0℃，保持30 min，向离心管中加入冰块，保持30 min后取出，即0℃处理的样品；然后将温度从0℃降至-1℃，保持1 h后取出，即-1℃处理的样品；以此类推至-7℃；每个处理3次重复。对照（CK）不进行低温处理。每个材料取出后放在冰上解冻，测量相应指标。

1.2.2 MDA、可溶性糖含量测定 用硫代巴比妥酸法参照林艳等[3]的方法，但略有改动。称取试材1 g左右置于研钵中，加入少量石英砂和10%三氯乙酸2 mL，研磨至匀浆，再加入8 mL 10%三氯乙酸进一步研磨成匀浆，转移到离心试管以5 000 r/min离心10 min，上清液为MDA提取液。取4支干净试管编号：3支为样品管（3个重复，各加入提取液2 mL），1支为对照管（加蒸馏水2 mL）；然后各管再加入2 mL 0.6%硫代巴比妥酸溶液。摇匀，混合液在沸水水浴锅中反应15 min，迅速冷却后取试管内上清液用WFJ7200型分光光度计测量其在波长450、532、600 nm下的吸光度（A）值。并按公式（1）和（2）分别计算MDA、可溶性糖含量：

式中，V为提取液体积（mL）；m为植物组织鲜重（g）；含量的单位为μmol/g。

1.2.3 电导率的测定 采用浸泡法，参照陈爱葵等[6]的方法。以冷冻后的离体马铃薯叶片为原料，在0℃至-7℃的温度范围内，测定各叶片在各温度时的相对电导率。取处理后离心管中的叶片，尽量保持叶片完整性，少含茎节。用蒸馏水冲洗干净，并用滤纸吸干叶片表面水分，剪成适宜长度的长条，迅速称量3份，每份0.1 g，分别置于含10 mL去离子水的试管中，封口，室温下浸泡12 h后用DDSJ-308A型电导率仪测定提取液电导率（R1），然后沸水浴20 min杀死叶片，冷却至室温，充分摇匀后测量浸提液电导率（R2）。电解质渗出率=（R1/R2）×100%，将每个温度3次测得的电导率计算平均值，与Logistic方程拟合。方程拐点即为材料的半致死温度。

1.2.4 DAB组织定位 参照张小莉等[7]的方法。取低温梯度处理后植物组织的叶片，用蒸馏水洗净后将其置于50 mL离心管中。取适量DAB染液（1 mg/mL，pH值为3.8），用NaOH调pH值至5.8，分别加入预处理的植物组织，28℃避光保存8 h。吸去各管染液，加入80%乙醇，沸水浴数分钟，吸出各管液体，加入无水乙醇并沸水浴直至叶片绿色完全脱去为止。加入无水乙醇，置于4℃冰箱内保存一段时间后观察。

1.3 数据处理与统计

采用Microsoft Excel和SPSS 17.0软件进行数据处理、差异显著性和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 电导法分析马铃薯耐冻性

2.1.1 低温梯度处理马铃薯叶片相对电导率的变化

由图1所示，本次试验的4个马铃薯材料其相对电导率均随冷冻温度的降低而升高，并且其升高幅度呈“慢—快—慢”的趋势，呈典型的“S”形曲线。

图1 不同品种马铃薯叶片经地温梯度处理后相对电导率的变化

2.1.2 马铃薯半致死温度分析 通过Logistic方程y=k/(1+ae-bx)[其中，y为实测细胞伤害率；x代表冷冻温度（℃）；k为细胞伤害率的饱和容量，即y的最大极限值，试验中k值为100；a、b为方程参数]对低温处理温度和相对电导率进行拟合，结果表明相关系数均达极显著水平（r=0.853-0.949，r0.01=0.834），表明拟合结果精确可靠，电解质外渗率与低温处理温度之间遵循Logistic方程的变化规律，用曲线拐点表示各马铃薯品种的半致死温度，即LT50=-lna/b。4个品种的半致死温度、Logistic回归方程及其拟合度如表1所示，所有材料半致死温度均在-2.5℃与-2℃之间，其中费乌瑞它的半致死温度最低，为-2.378℃，金山薯的半致死温度最高，为-2.136℃。根据半致死温度的大小，得到的马铃薯品种耐冻性由强到弱为费乌瑞它＞紫2＞兴佳二号＞金山薯。

表1 不同品种马铃薯叶片的Logistic方程和半致死温度

2.2 MDA及可溶性糖含量法分析马铃薯耐冻性

如表2所示，随着冷冻温度的降低，4个马铃薯品种MDA含量总体上呈上升趋势，但由于耐冻性的差异，温度降幅太大，导致部分品种表现出上升到极大值后又降低的趋势。其中，金山薯、兴佳二号在-2℃时，达到峰值，金山薯与对照呈极显著差异（P≤0.01），与兴佳二号呈显著差异（P≤0.05）；紫2在-3℃时达到峰值，并与对照呈显著差异（P≤0.05）；费乌瑞它直至-4℃MDA含量呈现持续上升趋势，且与对照呈显著差异（P≤0.05）。由此可见，费乌瑞它耐冻性强于紫2，兴佳二号和金山薯耐冻性最弱。

表2 不同品种马铃薯叶片MDA及可溶性糖含量随冷冻温度的变化及差异

随着处理温度的降低，4个马铃薯品种可溶性糖含量呈现下降和上升交替出现的现象。从总体看，可溶性糖含量随着处理温度的降低呈现先上升后降低的趋势。其中，兴佳二号呈“升—降—升”趋势；金山薯、紫2、费乌瑞它呈“降—升”趋势。可溶性糖是植物耐冻性的主要保护物质，可溶性糖的增多对耐冻有好的效果[8]。费乌瑞它在-4℃时可溶性糖含量最高，且与对照呈极显著差异（P≤0.01）。兴佳二号在-2℃时，可溶性糖含量最高，与对照呈极显著差异（P≤0.01）。金山薯在0℃时出现峰值，与对照呈极显著差异（P≤0.01）。这表明兴佳二号耐冻性强于金山薯。

图2 不同品种马铃薯经低温梯度处理后叶片中过氧化氢含量的变化

综上所述，由MDA及可溶性糖含量综合分析得到各马铃薯品种耐冻性强弱关系为费乌瑞它＞紫2＞兴佳二号＞金山薯。

2.3 DAB组织定位法分析马铃薯耐冻性

试验结果表明，随冷冻胁迫加强，叶片红褐色斑点或斑块越来越多，抗冻能力越差，叶片受害表象越明显。耐冻性强的品种，受到的伤害小，反之，受到的伤害大。各品种叶片表现如图2。由此可见，耐冻性最强的为费乌瑞它，最弱的为金山薯。各马铃薯品种的耐冻性由强到弱排列为费乌瑞它＞紫2＞兴佳二号＞金山薯。

3 讨 论

测定电解质外渗率拟合Logistic方程得到半致死温度，测定MDA含量、可溶性糖含量以及过氧化氢原位检测的方法都能比较出4个马铃薯品种的耐冻性强弱，且得到相同的结果，即各马铃薯品种的耐冻性由强到弱依次为费乌瑞它＞紫2＞兴佳二号＞金山薯。

但就各分析方法的试验过程以及数据处理而言，有如下特点。电导法简单便于操作，技术要求低，花费人工时间短，尤其拟合Logistic方程进行回归分析得到的半致死温度可以直观准确的表明各品种耐冻性强弱；但是电解质外渗率的测定受环境温度影响大，敏感度高，数据重复性较低，且破坏供试材料，使其失去自然态。MDA及可溶性糖含量的测定所需仪器，人员等均要求低，使实验便于操作实施，可操作性强；其缺点主要是操作过程较繁杂，所耗时间成本大，容易造成较大误差，重复性较低；并且数据处理相对其他方法来说复杂，分析过程较难。

而DBA组织定位法是将过氧化氢作为测定耐冻性的信号分子，所需仪器、人员要求极低，操作简单，人工时间成本小，得到结果速度快，表型特征明显，易于识别比较不同品种的耐冻性的大小，同时重复性强，干扰因素小。

4 结 论

过氧化氢的DAB组织定位检测可以同传统测定耐冻性的方法一样，用于检测所需植物的耐冻性。并且比传统方法操作简单、人工耗时少、干扰因素少、重复性高，更方便用于耐冻性研究，在马铃薯耐冻性资源的筛选与评价及耐冻性育种等领域均可推广使用。

[1] 徐 伟. 电导法测定无核葡萄的抗寒性[J]. 南方农业，2014，（6）：25-27.

[2] 巩慧玲，冯再平，蒋继明. 电导率法配合Logistic方程确定马铃薯低温驯化前后叶片的半致死温度[A]. 马铃薯产业与现代可持续农业[C]. 哈尔滨：中国作物学会马铃薯专业委员会. 2015.309-313.

[3] 林 艳，郭伟珍，徐振华，等. 大叶女贞耐冻性及冬季叶片丙二醛和可溶性糖含量的变化[J]. 中国农学通报，2012，28（25）：68-72.

[4] 苗雨晨. ABA诱导蚕豆气孔运动中H2O2和Ca2+信号转导机制研究[D]. 开封：河南大学，2002.

[5] 李 飞，雷尊国，刘 杰，等. 野生马铃薯材料苗期耐冻性鉴定[J].中国蔬菜，2008，（12）：6-10.

[6] 陈爱葵，韩瑞宏，李东洋，等. 植物叶片相对电导率测定方法比较研究[J]. 广东第二师范学院学报，2010，30（5）：88-91.

[7] 张小莉，王鹏程，宋纯鹏. 植物细胞过氧化氢的测定方法[J]. 河南大学生命科学学院，2009，44（1）：103-106.

[8] 阿依古丽·铁木儿，玉苏甫·阿不力提甫，等. 新疆地方梨品种耐冻性评价[J]. 中国农学通报，2014，30（28）：217-225.

（责任编辑：夏亚男）

The Comparison of Several Kinds of Potato about Cold Resistance Analysis Method

DING Xu，PAN Fei，XIE Jie，WANG Ming，LI Qing，QIN Yu-zhi
（College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC）

Mature blades from Favorita, Xingjia No.2, Jingshanshu, GS393 and Zi 2 as the experimental materials, leakage ratio of electrolyte(REC), DAB reaction , alondialdehyde(MDA), soluble sugar contents under low temperature gradient processing were measured, coming to a comprehensive analysis method which closely related with phenotypic correlation of cold resistance, high repeatability, and convenient operation. The results showed that electrical conductivity method is easy to operate with simple technical requirements. The experimental results intuitively indicated that the frost resistance strength of each type. However, the disadvantage is that the electrolyte leakage rate of determination is infuenced by environmental temperature, leading low data repeatability. Low instruments and personnel requirements are required to test Malondialdehyde (MDA) and soluble sugar contents, especially the well maneuverability. Its defect is that operation process is relatively complex, low repeatability and relatively complicated data processing compared with other methods. DAB reaction asks extremely low instrument, low researchers, simple operation and less artifcial time. It can product results quickly and obvious phenotypic characteristics, simply identify the strength of the comparing the frost resistance of different varieties. At the same time, it is more convenient for frost resistance research with high repeatability and less interference factors.

leakage ratio of electrolyte(REC); semi-lethal temperature(LT50); malondialdehyde(MDA) content; soluble sugar content; hydrogen peroxide; DAB reaction

S532

：A

：1006-060X（2017）06-0014-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.006.005

2017-04-24

湖南农业大学“大学生创新性实验计划项目”（XCX15130）

丁 旭（1996-），女，甘肃定西市人，本科生，园艺专业。

秦玉芝