植物源农药印楝素的研究与应用

徐汉虹， 赖 多， 张志祥

(1天然农药与化学生物学教育部重点实验室/华南农业大学 农学院，广东 广州 510642；2 广东省农业科学院 果树研究所/农业部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室，广东 广州 510640)

植物源农药印楝素的研究与应用

徐汉虹1， 赖 多2， 张志祥1

(1天然农药与化学生物学教育部重点实验室/华南农业大学 农学院，广东 广州 510642；2 广东省农业科学院 果树研究所/农业部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室，广东 广州 510640)

印楝素是目前世界上最优秀的植物源农药，田间登记应用已30多年，对全球作物保护和生态安全发挥了重要的作用。本文回顾了印楝素的发现和印楝在中国引种情况,总结了印楝素结构鉴定与全合成的历程，重点介绍印楝素拒食、抑制昆虫生长发育、诱导细胞凋亡和自噬的分子作用机理以及印楝分子生物学、印楝素生物合成研究的最新进展。1983年，赵善欢等成功地将印楝引种中国，随后我国许多学者开展印楝引种与繁育，种植面积曾超过6万hm2，为我国印楝素杀虫剂的规模化生产提供了原料保障。1997年印楝素以新化合物结构作为新农药在我国登记，实现了商业化应用，2014年成为农业部推荐使用的低毒低残留农药主要品种，获得了显著的经济和生态效益。我国学者发现了印楝素诱导细胞自噬现象，阐明了印楝素诱导细胞凋亡和自噬的分子调控机理。随着强化农产品质量安全的源头控制，印楝素的研究和应用将会越来越深入普及。今后要进一步加强基础研究，明确印楝素的分子靶标，为印楝素的科学使用提供理论基础。

印楝素； 印楝； 植物源农药； 拒食； 抑制生长发育

印楝素(Azadirachtin)是一种柠檬苦素类活性物质，属于四环三萜类化合物，主要从印楝AzadirachtaindicaA. Juss(图1)中分离提取，此外在菲楝A.excelsa[1]、泰楝A.siamensis[2]以及印楝内生真菌Eupenicilliumparvum[3]中也发现存在。印楝素是目前世界上公认的活性最强的拒食剂，对大多数昆虫和其他节肢动物的生长发育具有良好抑制作用，对脊椎动物安全，被认为是最优秀的生物农药之一，也是目前商品化开发最成功的植物源杀虫剂。由于其优越的生物活性、独特的作用机理和复杂的化学结构，印楝素一直是农药学乃至整个植物保护学科领域的研究热点，国内外有关印楝素和印楝的文献报道已超过2 000篇。近年来，印楝基因组的解析为印楝素生物合成途径提供了更多遗传信息，印楝素也成为我国农业部推荐使用的低毒低残留农药主要品种，其分子作用机理研究等方面也取得了较大的进展。随着我国化学农药零增长政策的实施，印楝素生物农药的应用会越来越普遍，影响越来越深远。为了更好地促进印楝素的健康发展，本文对印楝素的发现及历史、化学特性与合成、作用机理，特别是我国引种印楝及其开发应用等进行了总结和分析。

图1 印楝树及其花和果

Fig.1 The tree, flower and fruit of neem,Azadirachtaindica

1 印楝素与印楝

1.1 印楝素的发现及历史

印楝素的名字始于印度一种名为印楝的植物(图1)，而它的发现源于苏丹的一场蝗灾。1959年，德国著名昆虫学家Schmutterer教授在苏丹学习考察过程中目睹成千上万蝗虫入侵后，几乎所有植物被吃尽，唯独印楝树的叶子完好无损。回国后，他在德国基尔大学发起了从印楝树中分离对蝗虫具有拒食或忌避作用活性成分的倡议，由此引起西方国家学者对印楝的研究热潮[4-5]，他也被誉为“现代印楝之父”。然而，印楝素在印楝叶子中含量极低，不易分离得到。直到1968年，印楝素才被Butterworth等[6]从印楝的种子中分离出来，并命名为Azadirachtin。随后，印楝素另一种生物活性也被发现，即对害虫具有强烈的抑制生长作用[7]。印楝素的发现正好是《寂静的春天》出版引起全球对农药残留关注和美国禁止使用DDT法令颁布的时候，因而它的出现极大地引起了人们对天然农药的关注[4]。1980年Schmutterer教授在德国组织召开了第1次国际印楝大会，主题为印楝及其生物活性[8]。至今，在德国、印度、肯尼亚、加拿大、澳大利亚和中国等国家先后召开了8次国际印楝大会。我国于2001年在昆明还召开了中国印楝产业化发展国际研讨会，专门探讨印楝素的研究与开发，由此可见印楝素在天然农药中具有举足轻重的地位。

印楝素是一系列类似化合物的统称，包括印楝素A、B、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、O、P、Q等15种(图2)，其中，印楝素O、P和Q是2005年Kanokmedhakul等[9]从菲楝中分离出来的。事实上，这种命名源于过去对印楝素结构相似性的误解。1986年，Klenk等[10]从印楝中鉴定出一种与印楝素具有相同活性的新化合物3-tigloylazadirachtol。限于当时的技术水平，对印楝素结构认识仍很模糊，Rembold[11]将3-tigloylazadirachtol误认为印楝素的同分异构体，从而引入了印楝素A、B、C、D的名字。然而，除印楝素C未分离鉴定外，严格意义上，印楝素A、B、D并不是同分异构体，而是3个不同类型的化合物[4]。尽管如此，后人依然以此为参照将印楝或其他楝属植物中分离得到的系列类似化合物分别命名为印楝素E、F、G等，并沿用至今。

图2 印楝素A～Q的结构Fig.2 The structures of azadirachtins A-Q

1.2 印楝素的化学特性

在印楝素10多种类似物中，印楝素A的含量最高、拒食活性最强。值得注意的是，通常所说的印楝素是指印楝素A，其CAS登录号为11141-17-6，分子式C35H44O16，相对分子质量720.71。另一个重要成分是印楝素B(3-tigloylazadirachtol)，其CAS登录号为95507-03-2，分子式C33H42O14，相对分子质量662.69。印楝素B化学结构与印楝素A相似，含量和拒食活性低于印楝素A，但抑制昆虫生长发育的活性比印楝素A高。

印楝素A是无色或略带黄色的结晶或结晶性粉末，味微苦，熔点174 ℃，旋光度-13.1(c=1.75，丙酮)或-71.4 (c=0.21，CHCl3)，易溶于丙酮、乙醇、甲醇、二甲基亚砜等极性有机溶剂，微溶于水、氯仿和苯，分子中具有酯基、环氧基和烯醚基等不稳定基团，在紫外光、阳光和高温下极易分解。

印楝素属于四环三萜类化合物，其化学结构大体可分为十氢化萘和三环呋喃左右两部分，共含有16个手性中心，包括7个季碳、9个仲碳和16个氧原子[12]。这使其化学结构鉴定变得十分困难，印楝素自分离到结构的确定一共耗费了17年时间。1975年，Zanno等[13]提出了印楝素的第1个化学结构，尽管后来被证明是错误的[14-15]，但对印楝素正确的化学结构解析起到了一定的推动作用；至1985年，印楝素的化学结构才被Bilton等[14]正确地解析出来，随后得到了X射线晶体结构数据[16]和核磁共振NMR图谱证实[17]，成为印楝素化学结构鉴定史上的转折点。

1.3 印楝的分布及其在中国的引种

印楝属于楝科楝属常绿乔木，原产于印度次大陆印度、缅甸等地，现广泛分布于中南半岛、印度尼西亚、西非以及南美洲等热带亚热带干旱地区。早在1 000多年前，当地人就发现印楝在治疗麻风病、牙龈炎、皮肤病等方面的神奇功能，印楝树被当地土著居民封为“神树”。至1959年Schmutterer发现其具有杀虫活性后，全球兴起种植印楝的热潮。1993年，国际印楝网络(International Neem Network，INN)成立并致力于印楝种源的遗传改良、适应性评价和推广种植。联合国粮食及农业组织、联合国亚太经济与社会理事会、国际林业研究组织联盟等组织，推荐印楝为南亚、东南亚和非洲等干热地区优先发展的树种[18]，现已被引种到中国、美国、澳大利亚、斐济和毛里求斯等50多个国家。

印楝由于含有活性物质——印楝素而著名，联合国报告中称其为“20世纪对当地居民的最大恩赐”，被美国农业部誉为“可解决全球问题的树”[19]。印楝是印楝素生物农药产品加工的唯一原料，大多数研究都是围绕如何提高印楝中印楝素含量开展。印楝素含量差异主要取决于印楝的品种，也会受种植地气候条件(如温度、湿度、雨水)影响。根据生物气候区和纬度，印楝种源(原产地品种)被国际印楝网络划分为25个[20]，其中印度的种源最多，有8个(表1)。印楝从第2—3年开始结果，成熟的楝树可收获果实20～50 kg，收获期可延续几十年。印楝素在不同收获期果实中含量差异显著，随绿果形成而开始积累，大约10 d后含量达到了最大值，之后随着种子中油脂的积累，印楝素含量会稍微降低[21]。有研究报道可通过人工接种丛枝菌根来提高印楝种子中印楝素的含量[22]。印度学者则发现喷施多胺类物质(如腐胺、亚精胺和精胺)可提高印楝种子中印楝素的含量[23]。但是，这些技术措施在实际生产中均未得到推广应用。

印楝在我国无自然分布，1983年赵善欢首次将印楝从国外引入华南农业大学昆虫毒理研究室杀虫植物标本园并试种成功[24]。为了发展印楝素生物农药的原料基地，1986年赵善欢等[25]又成功地从非洲多哥将印楝树大面积引种到海南万宁县和广东省徐闻县，并建议在海南岛、雷州半岛和云南省西双版纳等地推广种植。印楝在引种地正常开花结果，果仁中印楝素含量与原产地相当。自此以后，我国开始大规模引种印楝，华南农业大学和中国林业科学研究院资源昆虫研究所等机构相继开展了大量的印楝引种、选育和驯化工作。原成都绿金生物科技有限公司董事长吴成奎在印楝种植和产业化方面作出了重要贡献，解培惠在攀枝花建立了印楝种质资源圃。目前，我国已成为世界上印楝人工种植面积最大的国家，高峰时云南省、四川省、海南省和广东省雷州半岛等地区种植面积曾超过6万hm2[26]，创造了我国植树史上继橡胶引种后的又一创举，为我国印楝素杀虫剂的规模化生产提供了原料保障。此外，印楝的大面积推广种植不仅具有构筑长江上游生态屏障、改善生态环境等生态效益，也为云南及四川金沙江、元江和怒江的广大农民开辟了一条脱贫致富的新路，对保护生态环境、防止水土流失、改良土壤、发展山区经济、促进农业可持续发展均具有重大的意义和深远的影响。在这过程中，我国政府及有关部门对印楝种植与开发极为重视，国家林业局、云南省科委及生物资源开发创新办公室均立项对印楝进行引种栽培和综合利用研究，云南省将印楝列为生物资源重点发展项目之一，四川省将印楝引种列为省府督办的1号工程，海南省把印楝种植作为建设生态省的重要项目。2001年，时任国务院总理朱镕基在听取了华南农业大学笔者有关印楝项目的汇报后，对印楝的生态保护作用给予了高度评价。2007年，笔者领衔的“印楝生态林建设与印楝环保农药的研究推广”项目获得了原国家环境保护总局授予的“环境保护科学技术一等奖”。

表1 国际印楝网络划分的印楝种源概况[20]Tab.1 Neem seed sources summarized by the International Neem Network

21世纪初期，印度科学家提出印楝基因组计划并于 2011 年宣告完成。该计划通过对印楝基因组测序分析，揭示印楝基因组大小为364 Mbp，编码约2万个基因，进化上与芸香科植物甜橙Citrussinensis近缘[27-28]，其序列信息可从印楝基因组数据库获得(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA176672)。目前，对印楝不同组织(根、茎、叶、花和果实)的转录组测序也相继完成[27, 29-30]，与此同时我国科研人员也完成了国内种植的印楝的转录组测序[31]。为全面揭示印楝中活性物质柠檬苦素类化合物的生物合成途径奠定了基础，也意味着对印楝的研究进入了分子生物学阶段。

2 印楝素的制备与合成

2.1 印楝素的生产制备

印楝的种子、叶片、枝条和树皮等多个部位均含有印楝素，其中种子的印楝素含量最高，w通常为0.3%～0.5%，个别品种最高可达1%。但是种子收获具有季节性，生产供给能力有限，其贮藏条件也对后续制备产生影响。国内外学者尝试通过植物组织培养技术对印楝素进行大规模稳定生产[32-37]，但这些技术仍需优化。目前印楝种子仍是提取制备印楝素的唯一有效途径。

印楝素的工厂化生产关键在于其原药提取制备工艺，通常包括以下2步：1)去油：压榨印楝种仁，得到印楝油，压榨后的残渣即是印楝饼。将印楝饼粉碎，得到种仁粉，该粉是生产印楝素原药的主要原料。2)印楝素原药的制备：以印楝种仁粉为原料制备，常用提取方法主要有溶剂萃取法、超临界萃取法和微波萃取法。其中,溶剂萃取法使用最多、最成熟；超临界萃取法由于整个分离过程在暗场中进行，萃取温度接近室温，特别适合对光热不稳定的印楝素提取。

2.2 印楝素的化学合成

实现印楝素化学合成是解决印楝素产品加工原料不足的重要手段。国内外许多研究人员对印楝素的全合成和骨架合成进行了大量研究。印楝素的化学结构复杂，是C-开环柠檬素类化合物，由于C-8和C-14的位阻使得C-8和C-14相连接困难。英国剑桥大学Ley教授的研究组于2007年首次完成了印楝素的全合成，整个过程包括71步反应，其中一个片断需48 步反应才能得到，最终总收率仅为0.000 15%[5,38]。由于合成路线长、收率低，Sanderson[39]称这一合成手段根本不具备实际生产意义，还不如从印楝种仁中直接提取分离方便。随后，Ley等[40]开始优化印楝素合成路线，并成功将其中一个片段的合成由 26 步缩短到 17 步。尽管无法实现工厂化生产，但是Ley 等的研究工作在复杂天然产物的全合成探索中仍然具有重要的里程碑意义，不仅为后人化学合成印楝素提供了思路，而且有助于人们更好地了解印楝素分子的中间代谢物及其衍生物对昆虫的生物活性。

在印楝素及其衍生物的构效关系研究方面，Yamasaki等[41]研究表明印楝素A的C-22与C-23位双键氢化加成后，明显增加了分子稳定性，而且印楝素的羟基对生物活性具有重要贡献，当具有亲油基团时活性较高。Simmonds等[42]指出印楝素母体分子碳环上C-7、C-11、C-22和C-23是决定生物活性的关键位置，基团取代能明显影响其活性。有学者认为印楝素母体分子结构的微小改变可能导致其对昆虫行为反应的变化。Madyastha等[43]利用生物催化法对印楝素的官能团和主体骨架进行修饰，所得化合物对昆虫具有较好的拒食活性。印楝素C-12位的—COOCH3不是其活性基团，但可明显提高其生物活性，将—COOCH3降解为—COOH，其生物活性有所降低，但没有出现质的改变，C-12水解的印楝素A对小菜蛾Plutellaxylostella、斜纹夜蛾Spodopteralitura和棉铃虫Helicoverpaarmigera幼虫具有较好的生物活性[44-45]。

2.3 印楝素的生物合成

由于印楝素化学合成的难度大，人们便把目光转向其生物合成。早期的研究主要集中于印楝素生物合成的化学代谢途径，近年来，随着基因组和转录组技术发展，人们企图去探明参与印楝素生物合成的关键基因或蛋白。借助放射性同位素示踪法，Akhila等[46]利用标记的乙酸和甲羟戊酸来研究印楝素及其类似物Nimbin和Salannin。尽管目前对其确切的合成途径还不清晰，但已初步描绘了印楝素生物合成的框架。类固醇三萜甘遂醇(Tirucallol)被认为是印楝中柠檬苦素三萜类次生代谢物的前体物[20,47]。首先，两分子法呢烯基焦磷酸(Farnesyl diphosphate，FPP)结合形成甘遂醇，甘遂醇通过烯丙基异构化反应生成丁酰鲸鱼醇(Butyrospermol)，丁酰鲸鱼醇被氧化重排形成Apotirucallol；接着，Apotirucallol侧链末端的4个碳被去除[47-48]，其余的碳环化形成呋喃环，然后进一步被氧化形成碳开环柠檬苦素类似物，如印楝二酮(Azadiradione)、Nimbin、茄碱苷(Salanin)[20,47,49]；最后，茄碱苷分子进一步氧化和环化形成印楝素以及Meliacarpin、Azadirachtol[4,50]，但是目前尚不能够明确这3个化合物形成的先后次序。

在分子生物学方面，印楝素在植物体内的生物合成途径研究正处于起始阶段，尽管取得了一些进展，但其合成机制仍不清楚。印楝素是印楝中一种高度氧化的柠檬苦素类化合物，初始合成路径分为4个阶段：第1阶段，合成C5骨架的异戊烯焦磷酸(IPP)和其双键异构体二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)；第2阶段，在法呢烯基焦磷酸合成酶作用下DMAPP加上2分子的IPP合成具有C15骨架的法呢烯基焦磷酸(FPP)；第3阶段，2分子FPP在鲨烯合成酶的作用下生成C30骨架的鲨烯，接着在鲨烯环氧酶催化下生成 2,3-环氧化鲨烯；第4阶段，2,3-环氧化鲨烯经过一系列的质子化、环化、重排和去质子化作用最终合成柠檬苦素类化合物。这4个阶段的合成反应需要多种酶参与完成，所涉及的酶大部分已清楚，但是对后续合成途径中甘遂醇至印楝素所需关键酶的了解很少。最近，Kuravadi等[30]联合第2代高通量测序和超高效液相色谱(UHPLC)技术对印楝果实、叶、花等各种组织的差异表达基因和印楝素类似物进行系统分析，通过权重基因关联网络分析(Weighted correlation network analysis，WGCNA)算法获得了150多个可能涉及甘遂醇至印楝素合成途径的候选基因，其中转酮醇酶和脱氢酶等基因在印楝果实中高表达。Krishnan等[27]则认为倍半萜和三萜类化合物生物合成途径中8个基因PS21、lytB/ispH、ispE、GGPS、FDPS、FDFT1、SQLE和(+)-neomenthol dehydrogenase在印楝体内代谢合成印楝素中起到重要作用。

3 印楝素的生物活性与作用机理

3.1 印楝素的生物活性

印楝素的防治谱非常广，对鳞翅目Lepidoptera、膜翅目Hymenoptera、鞘翅目Coleoptera等10余目400多种农、林、储粮和卫生害虫有生物活性[51]；对害虫的作用方式多种多样，包括拒食、抑制生长发育、忌避、胃毒和绝育等作用，其中以拒食和抑制昆虫生长发育尤为显著，这2种作用方式在植物源农药研究中也最具代表性。

印楝素生物活性的研究已有很多报道， Schmutterer[52]调查研究了印楝素对不同目昆虫的生物活性。华南农业大学昆虫毒理研究室从1981年开始对印楝提取物及印楝素的杀虫活性进行了研究，先后对菜青虫Pierisrapae、斜纹夜蛾、小菜蛾、中华稻蝗Oxyachinensis、亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis、东亚飞蝗Locustamigratoria、三化螟Tryporyzaincertulas、褐飞虱Nilaparvatalugens、稻纵卷叶螟Cnaphalocrocismedinalis、稻瘿蚊Orseoiaoryzae、玉米象Sitophiluszeamais、米象S.oryzae、荔枝蝽Tessaratomapapillosa、柑桔红蜘蛛Panonychuscitri、柑桔潜叶蛾Phyllocnistiscitrella、马尾松毛虫Dendrolimuspunctatus、黄脊竹蝗Ceracriskiangsu、青脊竹蝗C.nigricornis、松突圆蚧Hemiberlesiapitysophila、黑卵蜂Tiphodytesrobertae、拟环纹狼蛛Lycosapseudoamulata、家白蚁Coptotermesformosanus、粘虫Mythimnaseparata和致倦库蚊Culexfatigans幼虫等20多种昆虫进行了生物活性测定[53]。大多数研究都是用印楝不同部位提取物或印楝油来做试验，印楝素单体的活性效果往往不如那些含有大量活性未知的柠檬苦素类化合物的“印楝粗提物”；印楝粗提物中未知化合物、印楝油与印楝素具有协同增效作用[54-55]。

3.2 印楝素的作用机理

3.2.1 拒食作用 一般认为，印楝素直接或间接地通过破坏昆虫口器上的化学感受器，刺激其特异性抑制型感觉细胞，或者阻断对取食刺激物(如蔗糖)起反应的感受器受体细胞的信号输入，从而抑制昆虫的取食行为。Simmonds等[56]对草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda和烟芽夜蛾Heliothisvirescens等鳞翅目昆虫的神经生理学研究表明，印楝素可以刺激化学感受器上的抑制型神经元细胞，同时也会抑制对蔗糖敏感的神经细胞。Luo等[57]发现印楝素对菜青虫中间的栓锥感觉器的抑制型感受细胞虽然有很强的刺激作用，但对两侧栓锥感觉器的蔗糖、氨基酸和芥子糖苷感受细胞没有作用。Mordue等[58]对多食性和寡食性昆虫研究显示，印楝素及其大部分类似物对化学感受器的抑制型神经元细胞都有刺激作用，而多食性和寡食性昆虫对印楝素敏感性有较大的差异，但不能确定这种差异是否与化学感受器上神经元受体的特异性和密度有关。

Qiao等[59]利用电生理膜片钳技术在果蝇离体脑组织水平上研究了印楝素的拒食作用机理，发现印楝素通过抑制果蝇食道下神经节(Suboesophageal ganglion，SOG)区中间神经元的钙离子通道，降低胆碱能兴奋性突触后电流(mEPSCs)的频率，进而抑制SOG区胆碱能神经信号的传导。昆虫大多数味觉神经元投射于SOG，SOG是初级味觉信息的处理中心，与取食行为密切相关。推测印楝素通过抑制昆虫SOG兴奋性胆碱能突触传递和钙离子通道，干扰昆虫神经中枢系统信息传导和处理，从而起到对昆虫的拒食作用。

3.2.2 抑制生长发育 抑制昆虫生长发育是印楝素最显著特点之一。印楝素处理会导致昆虫体内蜕皮激素的滴度发生变化，如峰期延迟、下降或滞留时间延长，使其表现出不能正常蜕皮、蜕皮受阻死亡、蜕皮后形成幼虫-蛹中间体、畸形蛹、羽化延迟或永久幼虫等典型症状。为此，Ruscoe等[7]认为印楝素的结构与20-羟基蜕皮酮(即蜕皮激素)相似，可能直接与蜕皮激素竞争其受体从而抑制生长发育。实际上，这种观点是错误的，那是在印楝素化学结构尚未解析前对两者的误解。Koolman等[60]采用放射免疫法研究发现，印楝素并没有竞争蜕皮激素、也没有与蜕皮激素受体结合的活性，表明印楝素不能直接与蜕皮激素受体结合。此外，应用放射免疫技术对离体培养前胸腺(添加印楝素及促前胸腺激素PTTH)的研究表明，印楝素对前胸腺合成蜕皮激素没有直接作用[61-62]。说明蜕皮激素滴度的下降很可能是印楝素作用靶器官后的间接结果。赵善欢等[63]发现印楝素可导致亚洲玉米螟大脑萎缩，咽侧体和心侧体表现为稍肿大并较透明，前胸腺表现出病理变化症状。而放射性同位素标记印楝素的研究显示：印楝素对飞蝗若虫脑神经分泌蛋白的合成或释放具有抑制作用，但是印楝素不能突破血脑屏障，只能分布其周缘[64-65]。也有研究认为，印楝素并不直接干扰昆虫脑神经分泌蛋白的合成，只是间接影响其合成量[66]。

近年来，印楝素抑制昆虫生长发育的机理研究在分子水平上取得了一些重要进展。Lai等[67]构建了印楝素作用下昆虫的差异基因表达谱，提出印楝素通过昆虫幼虫营养-胰岛素信号途径调控蜕皮激素、抑制幼虫生长发育。在此基础上，研究发现果蝇成虫盘是印楝素的重要靶器官，印楝素通过诱导幼虫成虫盘发生细胞凋亡，上调胰岛素样肽dilp8表达，进而降低PTTH的分泌；在果蝇PTTH神经元、全脑或全身ptth过表达可明显减缓或消除印楝素对果蝇幼虫生长发育的抑制[68]。

也有学者认为印楝素对昆虫生长发育的抑制活性是由其拒食作用引起的间接效应。Mordue等[69]则认为印楝素拒食效应与抑制昆虫生长发育两者间是相互独立的作用方式。赖多[68]利用昆虫取食行为和发育检测模型测定了印楝素对果蝇幼虫取食和发育的影响，结果表明印楝素拒食与抑制昆虫生长发育是2个相互独立的作用方式，印楝素抑制昆虫生长发育不是由拒食作用引起的。

3.2.3 诱导细胞自噬和凋亡 印楝素引起昆虫个体发生复杂的生理效应，很大程度上影响了其机理的研究。从20世纪90年代开始，印楝素的作用机理研究逐渐从虫体转到细胞水平。自1993年Rembold等[70]报道印楝素可影响草地贪夜蛾卵巢细胞Sf9的增殖和蛋白合成后，β-微管蛋白[71-72]、肌动蛋白[73]和热激蛋白Hsp60[74]先后被认为是印楝素的可能靶标。但仍然难以解释印楝素引起昆虫生长发育抑制的复杂生理效应，例如，无法合理解析印楝素造成蜕皮激素滴度降低现象。

2008年以来，华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室在国内率先从细胞水平探讨印楝素的作用机理，从细胞形态学上分别证明了印楝素能够抑制粉纹夜蛾Hi-5、斜纹夜蛾SL-1、草地贪夜蛾Sf9和粉纹夜蛾BTI-Tn-5B1-4 等多种昆虫细胞增殖，影响细胞骨架正常功能，诱导细胞凋亡[75-78]。进一步研究表明，印楝素可促使Sf9细胞中线粒体膜电位下降、p53蛋白上调以及溶酶体通透性增加，从而诱发凋亡[79-81]。Huang等[82]研究发现印楝素致使细胞死亡的另一条途径，诱导细胞发生自噬，并通过抑制信号通路PI3K-AKT-Tor的磷酸化水平而诱导自噬产生，同时通过线粒体途径激活Caspase-3引发凋亡，且印楝素诱导的自噬信号先于凋亡发生，并通过激活tAtg5分子开关促发自噬向凋亡转化(图3)[83-84]。

图3 印楝素诱导昆虫细胞自噬和凋亡的分子机理模型[83]Fig.3 A proposed mechanism underlying model of molecular -induced autophagy and apoptosis in insect cells

4 印楝素的应用和展望

4.1 印楝素产品在中国的登记和应用

自第1个商品化印楝素产品于1985年在美国获批登记，印楝素生物农药在全球得到了广泛应用。目前，印楝素产品在中国、印度、斯里兰卡、美国、德国、意大利、瑞士、澳大利亚、新西兰、墨西哥、智利、加拿大等20多个国家获得登记。

中国由华南农业大学开发出了商品化的0.3%印楝素乳油制剂，1997年以新结构化合物在国内首先获得临时登记[85]。该制剂1999年获得“国家重点新产品”证书；2004年，印楝素植物性杀虫剂制剂获得首届“广东省发明专利金奖”。与华南农业大学建立校企合作的成都绿金生物科技有限责任公司是我国最早取得印楝素产品正式登记的生产企业，其产品主要包括10%印楝素母药和0.3%印楝素乳油。到2017年2月，我国共有印楝素生产企业13家，批准登记产品17个，其中包括2个原药、11个乳油制剂产品(含2个混剂)[86]。目前，印楝素杀虫剂已成为我国三大植物性农药品种之一，2014年成为我国农业部推荐使用的低毒低残留农药主要品种，主要用于防治十字花科蔬菜上的小菜蛾、菜青虫和斜纹夜蛾，茶树的茶毛虫Euproctispseudoconspersa和茶小绿叶蝉Empoascapirisuga，以及柑橘树的潜叶蛾、高粱的玉米螟、烟草的烟青虫、草原的蝗虫等害虫；在沙糖橘、荔枝、水稻、蔬菜等植物上都得到了成功的推广应用，在新疆草原的蝗虫、贵州仁怀高粱的蚜虫、四川雅安茶叶的叶蝉等害虫防治上取得了明显的经济效益和生态效益。

4.2 展望

印楝素作为全球公认的最优秀的生物农药，在中国推广应用已20年，为从源头上保障我国农产品质量安全作出了重要贡献，是中国农药发展历史上里程碑式的农药品种，影响深远。它使植物保护工作的目的回归到保护作物，而不是杀死害虫。印楝素作为天然的典型昆虫拒食剂，引领了“和谐植保”、“生态植保”的植物保护可持续发展方向。新农药不再强调快速杀死害虫，而是要求害虫不再取食或减少取食为害，昆虫拒食剂、忌避剂、生长发育抑制剂成为新农药发展的新亮点，广大农业生产者通过印楝素的使用认识到非杀生型、缓效型农药的经济效益更加明显，使用更加安全、环境压力小，这为替代高毒农药提供了坚实的理论支撑和物质保障。

印楝素对高等动物安全，对大鼠急性经口LD50值低至5 000 mg·kg-1，属于相对无毒级。印楝素的成功推广应用改变了人们“农药即是毒药”的观念，引领农药向更加安全的方向发展。目前，我国的农业生产主体还是分散生产，从业者众、文化素质相对较低，其生产观念的改变是一个长期的过程。今后，需要政府加大政策和资金支持力度，扶植一批印楝素生产的龙头企业，巩固和发展“印楝种植-印楝素提取-生物农药配制-安全农产品生产”的绿色产业链；加强基础研究，进一步明确印楝素的分子靶标，为印楝素的科学使用提供理论基础。

2015年农业部实施农药使用量零增长行动计划，史上最严的《食品安全法》正式实施，2017年2月新修订的《农药管理条例》获得国务院审核通过，对农药提出了更高的要求。大力推广应用“生物农药、高效低毒低残留农药，替代高毒高残留农药”必将进一步提速，印楝素生物农药也将迎来发展的新契机。

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【责任编辑 周志红】

Research and application of botanical pesticide azadirachtin

XU Hanhong1, LAI Duo2, ZHANG Zhixiang1

(1 Key Laboratory of Natural Pesticide and Chemical Biology, Ministry of Education/College of Agriculture，South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China； 2 Institute of Fruit Tree Research, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of South Subtropical Fruit Biology and Genetic Resource Utilization, Ministry of Agriculture, Guangzhou 510640, China)

Azadirachtin is primarily known as an effective botanical insecticide, it has been widely used in field practice for more than 30 years, and plays an important role in the global crop protection and ecological security. In this review, we traced the discovered history of azadirachtin and the situation of neem introduction, and summarized the molecular mechanism inducing autophagic apoptosis, the latest progresses of molecular mechanism and biosynthesis of azadirachtin, as well as molecular biology. The neem tree,AzadirachtaindicaA. Juss, was first introduced by Shin-Foon Chiu’s group into China in 1983, and then Chinese scholars made great efforts to introduce and breed neem tree, planted more than sixty thousand hectares of neem trees, which provided material guarantee for the large-scale production of azadirachtin pesticide in China. The commercial application of azadirachtin was authorized by China’s Ministry of Agriculture(CMA) as a new insecticide in 1997. Azadirachtin had become the main low toxicity and low residue pesticide recommended by CMA in 2014, and resulted in good social and ecological benefits. Chinese scholars discovered that azadirachtin could induce autophagy in insect cell, and illuminated the molecular regulation mechanism of apoptosis and autophagy induced by azadirachtin. As strengthening the source control of quality and safety for agricultural product, the research and application of azadirachtin will be more and more widespread. The basic research should be intensified for future work to find out the molecular target of azadirachtin, which will provide a theoretical basis for scientifical application of azadirachtin.

azadirachtin; neem; botanical pesticide; antifeedant; growth and development inhibition

2017- 02- 22 优先出版时间：2017- 06-21

徐汉虹(1961—)，男，教授，博士，E-mail：hhxu@scau.edu.cn

国家自然科学基金(31471793，31601699)；广东省应用型科技研发专项资金项目(2015B020230012)

S482.1

A

1001- 411X(2017)04- 0001- 11

优先出版网址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170621.1923.004.html

徐汉虹， 赖 多， 张志祥.植物源农药印楝素的研究与应用[J].华南农业大学学报，2017,38(4):1- 11.