稻田养殖沙塘鳢对稻田水体及底泥微生物群落结构及多样性的影响

赵翔刚，罗 衡，刘其根，赵良杰，蔡林荣，戴亮亮，张 真

(上海海洋大学，农业部水产种质资源与利用重点开放实验室，上海 201306)

稻田养殖沙塘鳢对稻田水体及底泥微生物群落结构及多样性的影响

赵翔刚，罗 衡，刘其根，赵良杰，蔡林荣，戴亮亮，张 真

(上海海洋大学，农业部水产种质资源与利用重点开放实验室，上海 201306)

为了研究养殖沙塘鳢(Odontobutisobscurus)对稻田水体及底泥的微生物群落结构及多样性的影响，2015年于浙江海盐江南四阡现代农业公司进行了沙塘鳢的稻田养殖实验，利用DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)技术对养殖过程中的稻田水体及底泥中细菌的16S rDNA片段进行指纹图谱分析。DGGE条带测序分析结果显示：稻田水体及底泥共检测到包括α-变形菌亚门(Alphaproteobacteria)、β-变形菌亚门(Betaproteobacteria)、γ-变形菌亚门(Gammaproteobacteria)、δ-变形菌亚门(Deltaproteobacteria)、ε-变形菌亚门(Epsilonproteobacteria)、绿菌门(Chlorobi)、酸杆菌门(Acidobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、蓝藻门(Cyanobacteria)等细菌门类。多样性分析结果显示，养殖沙塘鳢的稻田底泥微生物DGGE条带数多于常规养殖稻田，养殖稻田的底泥Shannon多样性指数2.86，显著高于常规稻田的2.27，同时养殖稻田养殖沟底泥的Shannon多样性指数随养殖时间由2.56变化到2.16。PCA(Principal Component Analysis)及DGGE聚类分析结果显示，养殖稻田的水体及底泥微生物群落结构与常规稻田存在较大差异。结果表明，稻田养殖环境的微生态条件可能优于常规稻田。

稻田养鱼；DGGE;沙塘鳢(Odontobutisobscurus)

我国在稻田养鱼有着悠久的历史，人们利用稻田的水环境，并对其加以改造，在种植水稻的同时养殖水产品，一方面使稻田的水资源、杂草、水生动物、昆虫等资源被充分利用，另一方面通过水产养殖动物的活动达到给稻田除草、增肥及灭虫的效果，合理地改善了水稻的生长发育条件，促进了稻谷的生长，实现稻鱼双丰收的目标[1]。谢建等[2]的调查表明，稻田养鱼模式相较于传统稻田可以减少68%的农药及24%的化肥使用量，稻鱼互利共生，鱼的活动可以减少水稻虫害而稻田也相应的为养殖鱼类提供适合的生长环境，并降低N、P对环境的污染。俞水炎等[3]研究表明，稻田放养草鱼、鲤、尼罗罗非鱼后,对早稻第3代白背飞虱的虫口能减少34.48%～74.31%,晚稻第5代褐飞虱可减少51.23%～55.49%,早稻2代二化螟下降44.26～51.10%,早稻纹枯病减轻42.65%～59.91%。并可基本控制本田期萌生稗草、牛毛毡、矮慈菇等19种杂草。林传政等[4]研究显示，不同稻鱼共生方式对中稻、再生稻主要农艺性状及稻、鱼产量有影响。平作稻养鱼和平作稻凼式养鱼共生方式水稻单产能保持平作稻产量水平，增收鱼53.6～69.4 kg/667 m2，增加纯收益745～780元/667m2；垄稻沟鱼共生方式水稻单产比平作稻增产9.13%，增收鱼66.9 kg/667m2，增加纯收益1 040元/667m2。当前国内外大多数的研究主要集中于稻鱼共生互利机制、稻田养殖病虫害控制及经济效益等机关研究，而国内对于稻鱼共生系统中养殖生物对微生物的影响的研究鲜见。

众所周知，细菌既是分解者，又可作为水生生物的间接或直接饵料，与此同时，水体中细菌对腐质碳的矿化作用在水体碳循环中也起着重要作用[5]。大量实验证明，稻田土壤微生物群落在推动土壤有机质积累、转换、矿化及N的释放过程中扮演着十分重要的角色[6]。田相利等[7]研究发现草鱼(Ctenopharyngodonidellus)、鲢(Hypophythalmichthysmolitrix)和鲤鱼(Cyprinuscarpio)的三元合理混养使得系统中微生物的结构和功能得到优化，细菌群落的组成与代谢功能更趋于丰富化和多样化。鉴于微生物在生态系统中的重要作用，深入研究不同养殖模式下环境中微生物数量和功能，对于进一步理解微生物在人工生态系统中的作用及其机制具有十分重要的意义[8]。

沙塘鳢(Odontobutisobscurus)隶属鲈形目(Perci-formes)虎鱼亚目(Gobioidei)沙塘鳢科(Odontobuti-dae),为东亚特有的小型淡水底栖肉食性鱼类,特别是在江浙地区为传统的名贵食用鱼，具有较高的渔业价值[9]。目前稻田养殖沙塘鳢的研究报道鲜见。本研究基于DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)分子技术对稻田养殖沙塘鳢对稻田水体及底泥微生物的影响进行探究，以期为研究稻田沙塘鳢种养模式优化、了解共生机制提供理论依据，为后续研究稻田养殖沙塘鳢的研究者提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验设计

本实验共设计了六个实验田，其中四个为稻田养殖沙塘鳢组，其余两个为常规稻田组，六个稻田面积均为6 670 m2，养殖沙塘鳢的稻田四周具有环沟，宽度为3.5 m，深0.8 m，稻田内部有三条纵沟，长40 m，宽3 m，深0.7 m，常规稻田无沟。四个养殖稻田均放养密度为0.5尾/m2，养殖规格为平均2 cm/尾的沙塘鳢。除此之外，养殖稻田每亩还增加放养了规格为3～4 cm/尾的抱卵青虾1.5 kg。养殖过程中不使用化肥及农药。

1.2 样品采集及处理

分别于7月、9月、10月进行样品的采集，水样采用5 L的采水器于水面下方0.2 m处采集，分为七个采集点，均为每条养殖沟的中部位置，七个点混合在无菌桶内用500 mL的无菌瓶进行收集，泥样采集在稻田中随机采集7个点的稻田表层泥及于养殖沟中7个点采集水底表层泥，装入无菌收集瓶内，样品采集后，保存于-20 ℃冰箱。水体样品采用0.22 μm滤膜进行抽滤，抽样体积为200 mL。在实验室中将四个实验组的底泥样品进行充分混匀，最终每次采样得到三个待测样品，G#(养鱼稻田沟中样品)D#(养鱼稻田样品)K#(常规稻田样品)，按次序分别记录为第一次(G1#、D1#、K1#)、第二次(G2#、D2#、K2#)、第三次(G3#、D3#、K3#)采样。水样以s表示，泥样以n表示。

1.3 样品DNA提取

泥样中微生物DNA的提取利用上海博彩生物科技公司的土壤DNA抽提试剂盒进行提取，水样中微生物DNA的提取，首先用灭菌的剪刀及镊子将滤膜充分剪碎，置于1.5 mL灭菌的离心管中，接下来利用上海博彩生物科技公司的3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒V2.2进行样品DNA的提取。

1.4 PCR反应及DGGE电泳

本实验中，扩增的DNA片段为细菌的16S部分序列，引物为357F-GC-clamp和518R[10],扩增长度为220～230 bp，使用Peltier Thermal Cycle-200 PCR仪完成，模式为降落PCR(touchdown-PCR,td-PCR)[11]。反应体系为50 μL，包括引物357F-GC-clamp 1 μL，518R 1 μL，dNTP 1 μL，10×Buffer 5 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 40.5 μL，DNA模板1 μL。反应程序设定：95 ℃预变性5 min，94℃变性1 min，65 ℃退火1 min(每个循环退火温度降低0.5 ℃直至55 ℃)，72 ℃延伸30 s，以上进行20个循环，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，此过程进行15个循环，72 ℃最终延伸8 min，产物用琼脂糖凝胶电泳检测。

利用美国Bio-Rad公司生产的D-code System电泳仪进行DGGE分离实验，DGGE条带的切割和扩增；DNA载体连接、转化；细菌群落的挑选方法等参考唐永涛等[12]的实验。

1.4 分析方法及运用的公式

数据处理利用BIO-RAD Quantity One 4.6.2软件，PCA分析利用SPSS、EXCEL软件，微生物的多样性指数以条带数目S、Shannon多样性指数H、Simpson优势度指数λ、Margalef丰富度指数R及Pielou均匀度指数J为参考进行计算，以下为各指数计算方法：

H=-∑[(ni/N)ln(ni/N)]

λ=∑[ni(ni-1)/N(N-1)]

R=(S-1)/lnLN

J=H/lnLS

注：S为每个电泳条带中光亮的条带数；ni为第i个条带的光密度值；N为某一电泳条带的总的光密度。

2 结果

2.1 微生物群落结构及多样性统计分析

2.1.1 不同样品的多样性指数

泥样G1n#、G2n#、G3n#的平均Shannon多样性指数H为2.25，D1n#、D2n#、D3n#的平均Shannon多样性指数H为2.86，K1n#、K2n#、K3n#的平均Shannon多样性指数H为2.27。水样G1s#、G2s#、G3s#的平均Shannon多样性指数H为2.22，D1s#、D2s#、D3s#的平均Shannon多样性指数H为2.34，K1s#、K2s#、K3s#的平均Shannon多样性指数H为2.36。Shannon多样性指数HG1s#>G2s#>G3s#，D2s#>D3s#>D1s#,K2s#>K3s#=K1s#(表1)。

表1 不同样品的多样性指数Tab.1 Diversity index of different samples

2.1.2 DGGE聚类分析

2.1.2.1 泥样聚类分析

根据泥样聚类分析图(图1)可以看出，G1n#、G2n#、G3n#聚在一起，D1n#、D2n#、D3n#聚在一起，K1n#、K2n#、K3n#聚在一起，可以看出三次采样养殖稻田底泥、常规稻田底泥、养殖稻田沟底泥都各自具有较高的相似性，且表现出空间距离差异，不同地点采集的样品聚类距离较远。

图1 泥样聚类分析Fig.1 Cluster analysis of mud samples

2.1.2.2 水样聚类分析

从图2中可以明显看出采样初期G1s#、K1s#、D1s#具有较高的微生物群落结构相似性，三者聚在一起。第二次采样G2s#、D2s#、K2s#三者距离相对较远，表现出空间上的差异，说明随着养殖的进行微生物群落结构开始出现分化。后期采样聚类结果同样表现出空间差异，G3s#与D3s#相聚较近，与K3s#距离较远，到养殖后期养殖稻田水与养殖稻田沟中水的微生物群落结构相似性较大，而与常规稻田则相似性较低。另外，聚类还显示，G1s#与G2s#、G3s#距离较近，而D1s#与D2s#、D3s#距离较远，K1s#与K2s#、K3s#亦距离较远，可以看出随着养殖时间推移，养殖稻田沟微生物群落结构相似性较高，系统稳定。而养殖稻田及常规稻田的微生物群落结构则发生变化，到后期趋于稳定。

图2 水样聚类分析Fig.2 Cluster analysis of water samples

2.1.3 PCA分析

2.1.3.1 泥样PCA分析

通过主成分分析法根据各条带因子得分系数利用PC1、PC2这两个占比超过50%的主成分因子构建PCA二维图，从图3中可以看出，三次采样养殖稻田底泥、养殖稻田沟底泥、常规稻田底泥均各自聚集在一起，位置很接近。而每一次采样的G#、D#、K#均位置较远。

2.1.3.2 水样PCA分析

水样PCA图(图4)显示，第一次采样G#、D#、K#位置接近，从第二次采样开始出现分化，G#、D#、K#位置相距较远，第二次及最后一次采样G#与D#位置相对接近，与K#位置相对疏远。水样及泥样的PCA分析结果与DGGE聚类分析结果相似。

图3 泥样PCAFig.3 PCA of mud sample

图4 水样PCAFig.4 PCA of water samples

2.2 DGGE切胶图谱及物种测定结果

分别对DGGE图谱上较为清晰且具有一定明显特征的条带进行切割，水样和泥样分别切割8、10个条带(图5、图6)。将条带进行回收并重新克隆后进行测序，所得到的DNA片段通过U.S National Library of Medicine 的nucleotide blast项目进行匹配，找出相似性较高的物种，相似性在93%～100%之间结果显示，总共匹配的物种门类分别是变形菌门(α-变形菌亚门、β-变形菌亚门、γ-变形菌亚门、δ-变形菌亚门、ε-变形菌亚门)、绿菌门、酸杆菌门、厚壁菌门、放线菌门、蓝藻门。养殖稻田沟底泥主要的细菌为β-变形菌亚门、ε-变形菌亚门、绿菌门、酸杆菌门。养殖稻田底泥主要的细菌门类为ε-变形菌亚门、绿菌门、酸杆菌门、β-变形菌亚门、δ-变形菌亚门。常规稻田主要细菌门类为ε-变形菌亚门、厚壁菌门、α-变形菌亚门、酸杆菌门、β-变形菌亚门、γ-变形菌亚门、δ-变形菌亚门。绿菌门没有出现在常规稻田中，α-变形菌亚门、厚壁菌门、γ-变形菌亚门只出现在常规稻田(表2)。

水样匹配的细菌门类为放线菌门、蓝藻门、α-变形菌亚门。第一次样品各个不同位置的细菌门类相似，含有放线菌门、蓝藻门、α-变形菌亚门。第二次及第三次采样均未在常规稻田中发现放线菌门、蓝藻门聚球藻属、α-变形菌亚门。蓝藻门色球藻属第二次及第三次采样未在养殖稻田沟水体中出现(表2)。

图5 泥样切胶图谱Fig.5 Rubber cutting map of mud samples

图6 水样切胶图谱Fig.6 Rubber cutting map of water samples表2 16S rDNA-V3区片段序列比对结果Tab.2 Comparison of 16S rDNA-V3 sequences by sequencing and BLAST analysis

条带编号基因登记号同源性最近种类相似度N1HM535225.1Thiobacillusthioparus97%N2KM979608.1Sulfuricurvumsp98%N3LC076472.1Sulfurirhabdus98%N4JQ669498.1Chlorobibacterium93%N5KM200457.1UnculturedAcidobacteriabacterium96%N6GU257819.1UnculturedZoogloeasp99%N7KT428289.1Pelagibacasp97%N8KT322923.1UnculturedAnaeromyxobactersp98%N9AB811051.1Legionellagresilensis93%N10KM585603.1Cetobacteriumsp99%S1GQ366691.1UnculturedKnoelliasp97%S2HQ707131.1UnculturedCyanobacteriumsp94%S3JN371211.1Unculturedactinobacterium97%S4KT893450.1Synechococcussp100%S5EF088332.1Merismopediasp100%S6KT893450.1Synechococcussp100%S7AB920864.1UnculturedHyphomicrobiumsp100%S8JN409246.1Unculturedcyanobacterium99%

3 讨论

微生物群落是水体生态系统重要的组成部分，在水体中氮、 磷、 硫和碳等要素的循环和利用中起到至关重要的作用[13]。土壤的功能及维持很大程度上取决于微生物的活动[14]。细菌多样性对其所在的生态系统所发生的生化反应具有重要的影响，因此，对环境中细菌多样性的研究可以用来监控环境变化[15]。李成芳等[16]研究结果表明，与常规稻作相比,稻鸭共作能显著提高土壤微生物数量,其中细菌数最多,放线菌次之,真菌最少。本实验检测出的沙塘鳢养殖稻田系统中底泥的变形菌最多，其余还有绿菌门、酸杆菌门等，常规稻田中检测出的β-变形菌亚门、δ-变形菌亚门、酸杆菌门与陈俊辉等[17]研究得出的稻田土壤常见微生物种类相符合。电泳条带的多少，可以直观反映出样品中细菌群落的遗传多样性，多样性指数又是用以衡量群落物种数及个体的分布均匀度的一个综合指标[18]。本实验中，K1n#的物种条带数比D1n#的少6条，K2n#的物种条带数比D2n#的少8条，K3n# 的物种条带数比D3n#的少10条，G1n#、G2n#、G3n#的平均Shannon多样性指数为2.25， D1n#、D2n#、D3n#的平均Shannon多样性指数为2.86，K1n#、K2n#、K3n#的平均Shannon多样性指数为2.27，无论是物种的条带数还是Shannon指数，养殖沙塘鳢的稻田均优于常规稻田，说明稻田养殖沙塘鳢可以增加稻田底泥微生物种类数及微生物多样性，使底泥环境更加稳定，从而有利于养殖生物的生长及水稻的生长。从PCA及DGGE聚类图的结果及分析可以得出，稻田养殖沙塘鳢可以对稻田的底泥微生物群落结构产生较大的影响。G1n#>G2n# 、G3n#，养殖稻田的沟底泥微生物多样性由高到低变化。

唐永涛等[12]通过样品的聚类分析得出，虾单养(SH1#)和虾与三角帆蚌混养(SH3#)水体菌群组成和群落结构相似性较高，而虾和鲢鳙混养(SH2#)和虾、三角帆蚌、鲢鳙混养(SH4#)相似性较高，SH1#、SH3#与 SH2#、SH4#距离较远，相似性很低。本实验的水样DGGE聚类图及PCA图同样清楚地反应了个样品之间的聚类远近，除了前期差异不明显，可能是前期各组的进水来自同一个蓄水池，所以无法显现微生物群落结构的差异，G2s#、D2s#、K2s#相聚较远，G3s#、D3s#、K3s#也相聚较远，表现出不同采样点之间的空间差异，这也充分体现了沙塘鳢养殖稻田对于稻田水体及沟中微生物群落结构的影响，第二次及第三次样放线菌门、蓝藻门、α-变形菌亚门只出现在稻田养殖系统水体中，且蓝藻门色球藻属只出现在养殖稻田的沟中水体，这说明沙塘鳢养殖稻田的微生物种类要比常规稻田的稻田水体丰富，这也从一个侧面体现了沙塘鳢稻田养殖模式的优越性。物种条带数及Shannon多样性指数各采样点间数据没有明显的差异(P>0.05)。G1s#与G2s#、G3s#从图中可以看出相聚较近，D1s#与D2s#、D3s#距离较远，K1s#与K2s#、K3s#亦距离较远，前者体现了养殖稻田沟的水体微生物群落结构三次采样时间相似度较高，说明养殖稻田的沟的水体环境相对养殖稻田的稻田水体环境及常规稻田的水体环境要稳定。

研究发现，稻田底泥中变形菌门的种类最多，这与陈香碧等[19]进行的变形菌的相关研究得出的研究区土壤4中类型样地中分布最广、多样性最高的细菌类群是变形菌的结果一致。酸杆菌门是苯酚的主要降解菌[20]，本实验中它在不同的采样点均有出现，这也体现了此类细菌在稻田的常见性。在张锐[21]的研究中发现，厌氧脱氮系统中存在变形菌门、 拟杆菌门和绿菌门这几种主要的细菌，变形菌同样是最主要的菌群，同时这也发现绿菌门也参与脱氮反应，在本实验中绿菌门没有出现在常规稻田，说明可能沙塘鳢养殖稻田的环境更适合它生活，从侧面反映出沙塘鳢养殖稻田微生物群落结构的丰富，这也有可能与绿菌门的习性有关，绿菌门主要是一些厌氧光合细菌，这就可以解释其只在沙塘鳢养殖稻田出现的原因了，可能是养殖稻田的水体深度较之常规稻田深，形成了微弱的厌氧环境，更适合其生存，但是由于此类细菌均为未被培养的细菌，很难鉴定其在生态中的理化特性及功能[22]。本实验中厚壁菌门只在常规稻田出现，而韩岗等认为，厚壁菌门细菌是一类生活在肠道内的与脂肪有关的细菌，可见此类细菌可能会造成水体的污染，沙塘鳢养殖稻田中检测出厚壁菌门说明此养殖模式从一定程度上有利于环境的净化，提高生态系统的安全性。后期的水体样品显示，常规稻田所含有的优势细菌门类远少于沙塘鳢养殖稻田，而养殖稻田沟的种类亦小于养殖稻田，可以得出，沙塘鳢养殖稻田的稻田水体的优势菌群数最丰富。

稻田引入沙塘鳢，可以提高稻田底泥的微生物多样性及改善其群落结构，丰富底泥微生物的种类数。对稻田的水体微生物群落结构具有一定的影响，提高其微生物种类数目。研究发现，沙塘鳢养殖稻田养殖沟渠中水体的微生物群落结构更加稳定，底泥多样性出现由高向低变化。α-变形菌亚门、γ-变形菌亚门只出现在常规稻田，沙塘鳢稻田养殖对于微生物具体的影响方式等还有待进一步的研究探讨。

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(责任编辑：张红林)

Influence of the cultured Odontobutis obscurus to the microbial community structure and diversity in rice-fish system

ZHAO Xiang-gang,LUO Heng,LIU Qi-gen,ZHAO Liang-jie,CAI Lin-rong,DAI Liang-liang,ZHANG Zhen

(KeyLaboratoryofAquaticGeneticResourceandUtilization,MinistryofAgriculture/ShanghaiOceanUniversity，Shanghai201306,China)

In order to study influence of the culturedOdontobutisobscurusto the microbial community structure and diversity in rice-fish system.We investigated the microbial diversity of the water and sediment in rice-fish system using DGGE technology in Haiyan,Zhejiang.In this study,we detected species of Alphaproteo bacteria,Betaproteo bacteria,Gammaproteo bacteria,Deltaproteo bacteria,Epsilonproteo bacteria,Chlorobi,Acido bacteria,Firmicutes,Actino bacteria,Cyano bacteria.Diversity analysis showed that the number of sediment microbial species in rice-fish system were higher than that in the conventional rice fields.The Shannon-Weiner index in sediment of the rice-fish system was 2.86,significantly higher than 2.27 of the conventional rice field The Shannon-Weiner index in sediment was declined from 2.56 to 2.16 along the cultured process in rice-fish system.PCA and DGGE results showed the obvious differences of the microbial community structure in water and sediment between the rice-fish system and the conventional paddy fields,which indicated the cultured speciesO.obscurusmay play an important role in the regulation of the microbial community structure.

rice-fish system;DGGE;Odontobutisobscurus

2016-03-29；

2017-04-24

公益性行业(农业)专项：淡水池塘工程化改造与环境修复技术研究与示范(201203083)；上海市高校知识服务平台项目(ZF1206)

赵翔刚(1989- )，男，硕士研究生，专业方向为池塘生态养殖。E-mail:zxg198908@gmail.com

刘其根。E-mail: qgliu@shou.edu.cn

S931.3

A

1000-6907-(2017)04-0008-07