石斛‘火鸟’茎尖诱导类原球茎的组培快繁技术研究

王泽祺，孟金玲，崔永一

（1. 浙江农林大学 风景园林与建筑学院，浙江 临安 311300；2. 浙江农林大学 农业与食品科学学院，浙江 临安 311300）

石斛‘火鸟’茎尖诱导类原球茎的组培快繁技术研究

王泽祺1，孟金玲1，崔永一2

（1. 浙江农林大学 风景园林与建筑学院，浙江 临安 311300；2. 浙江农林大学 农业与食品科学学院，浙江 临安 311300）

以石斛‘火鸟’Dendrobium nobile ‘Huoniao’ 茎尖为外植体，用不同植物生长调节剂及不同基础培养基对原球茎的诱导、增殖、分化及生根培养进行试验。结果表明，类原球茎的诱导最适宜的基本培养基为MS，生长调节剂为0.2 mg·L-1的2,4-D，诱导率达到92%。不同浓度NAA处理，以1.0 mg·L-1的增殖效果最好，类原球茎生长较好，增殖系数达3.55倍。类原球茎的分化培养以0.5 mg·L-1NAA效果最好。添加5%椰乳，1 g·L-1活性碳最有利于石斛壮苗生根。试验显示‘火鸟’类原球茎诱导、增殖和分化培养条件分别为：MS+ 2 mg·L-16-BA +0.5 mg·L-1NAA + 0.2 mg·L-12,4-D；1/2MS+0.05 mg·L-1KT + 1.0 mg·L-1NAA；1/2MS+0.5 mg·L-16-BA + 0.5 mg·L-1NAA。在光照培养箱中光照强度1 500 Lx和温度25℃条件下，‘火鸟’组培苗移栽成活率达86%。

石斛‘火鸟’；组织培养；茎尖；类原球茎；移栽驯化

石斛‘火鸟’Dendrobium nobile ‘Huoniao’ 为兰科Orchidaceae石斛属Dendrobium植物，早春开花，在商业上常以春石斛命名。其花色艳丽、观赏期长，具有较高的观赏价值[1]。目前石斛生产上主要采用茎段扦插、高芽切取、组织培养3种方法。其中组织培养是现代化繁殖手段，国内外相关文献也有报道[2-5]。王春[6]研究发现在培养基中加入适量BA有助于原球茎增殖。廖飞雄等[7]发现适量的KT处理，能有效的从芽苗的基部诱导类原球茎。王玉英等[8]试验得出诱导和增殖培养可在同一培养基中进行，降低培养成本和转接过程的污染率。王亚平等[9]对美花石斛Dendrobium loddigesii的诱导、增殖、分化及生根做了相关的研究。然而茎尖培养诱导类原球茎[10]难度大、茎段培养中存在繁殖系数低、株间个体存在差异等问题，也是石斛产业化生产中的瓶颈，亟待解决。

本研究对石斛‘火鸟’茎尖进行组织培养，构建其快繁体系，为快速生产‘火鸟’优良种苗，促进产业发展提供理论依据。同时对其他石斛属植物的快速繁殖和产业化发展也具有一定参考意义。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为由浙江森禾种业股份有限公司提供的石斛品种‘火鸟’的无菌苗。

1.2 方法

1.2.1 试验基本条件 试验所有培养基每瓶40 mL分装在组培瓶内，在121℃，0.14 MPa高温高压下灭菌20 min。材料接种后，2 000 Lx的光照下培养，每天光照12 h，培养温度25±1℃。

1.2.2 类原球茎诱导培养 取‘火鸟’腋芽上茎尖，解剖刀切取2 ~ 3 mm接种在类原球茎诱导培养基中，每个处理接种5瓶，每瓶接种2个茎尖，重复3次。培养基的其他附加物有蔗糖30 g·L-1、琼脂6.5 g·L-1、椰乳150 ml·L-1、活性炭2 g·L-1，调节pH=5.6±0.01。由于细胞分裂素和生长素之间存在交互作用，可能对类原球茎的诱导有一定的影响，本试验采用4因素3水平L27(313)正交设计方案，培养45 d后调查收集各个处理的生物量变化相关数据，计算成活率及诱导率。

基本培养基设置3个水平：MS，1/2MS，KC；6-BA设置3个水平：0.5，1.0，2.0 mg·L-1；NAA设置3个水平：0.1，0.5，1 mg·L-1；2,4-D设置3个水平：0.2，0.4，0.8 mg·L-1（表1）。

表1 茎尖诱导类原球茎正交设计Table 1 Orthogonal design for induction of protocorm-like bodies(PLBs)

1.2.3 类原球茎增殖培养 以诱导出的类原球茎为外植体，培养在1/2MS+蔗糖30 g·L-1+琼脂6.5 g·L-1+椰汁150 ml·L-1+0.05 mg·L-1KT的培养基上，调节pH=5.6±0.01，设置0，0.5，1.0和2.0 mg·L-1不同NAA浓度梯度，每个处理接种8瓶，每瓶接种5块，每块重0.4 g长势均一的‘火鸟’类原球茎材料，重复3次。培养45 d后调查收集各个处理的生物量，计算增殖系数。

1.2.4 类原球茎分化培养 将继代增殖的原球茎培养在1/2MS+蔗糖30 g·L-1+琼脂6.5 g·L-1+椰汁150 ml·L-1+0.5 mg·L-16-BA的培养基上，调节pH=5.6±0.01，设置0 ，0.1，0.2，0.25和0.5 mg·L-1不同NAA浓度梯度，每个处理接种8瓶，每瓶接种5块，每块重0.4 g长势均一的‘火鸟’类原球茎材料，重复3次。培养45 d后调查收集各个处理的生物量，统计分化情况。

1.2.5 试管苗的生根壮苗培养 以MS+0.5 mg·L-1IBA +0.1 mg·L-1NAA+蔗糖30 g·L-1+琼脂6.8 g·L-1为培养基，活性炭设置3个水平（0.5，1.0，2.0 g·L-1），不添加作为对照。将增殖培养得到的试管苗分割，接入生根培养基中，每个处理接种8瓶，每瓶接种5株，45 d后统计生物量的变化。

把长2 ~ 4 cm的试管苗，接种在MS+0.5 mg·L-1IBA +0.1 mg·L-1NAA+蔗糖30 g·L-1+ 6.8 g·L-1+活性炭1 g·L-1培养基中，分别添加5%的椰乳、香蕉汁、马铃薯汁和苹果汁，不添加为对照，调节pH=5.6±0.01。每个处理接种8瓶，每瓶接种5株，45 d后统计生物量的变化。

1.2.6 ‘火鸟’的移栽驯化 不同光照强度对‘火鸟’组培苗移栽成活率的影响。将‘火鸟’驯化苗放入光照培养箱中进行试验，设3个光照强度水平，分别为1 500，2 000，3 000 Lx，每个处理45株，重复3次，共计135株。每隔7 d观测1次成活率，连续观测7周。

不同温度对‘火鸟’组培苗移栽成活率的影响。将‘火鸟’驯化苗放入光照培养箱中进行试验，设3个温度水平，分别为20℃，25℃，30℃，试验各温度误差为±1℃，光照强度设置1 500 Lx，光照时间设置为14 h/10 h（光照/黑夜），相对湿度85%。每个处理45株，重复3次，共计135株。处理50 d后统计生物量的变化。

1.3 数据处理

鲜重的测定使用分析天平。3个处理以内的采用t检验，并采用LSD法测验不同处理的差异显著性。数据分析软件为SPSS 16.0。

2 结果与分析

2.1 ‘火鸟’类原球茎的诱导

‘火鸟’茎尖诱导类原球茎成活率与诱导率见表2。根据表2结果对类原球茎诱导率进行方差分析，结果见表3。

表 2 茎尖诱导类原球茎成活率与诱导率Table 2 Survival rate and induction rate of PLBs

方差分析结果表明，处理总效应达到0.01的极显著水平；4因素中基本培养基和2,4-D两个因素对茎尖诱导类原球茎的效应达到了极显著水平，6-BA和NAA对诱导类原球茎的作用不显著；说明基本培养基和2,4-D对‘火鸟’类原球茎的诱导起主导作用。基本培养基对‘火鸟’类原球茎诱导率的影响见表4，对其进行差异性配比（表5）。

表4、表5表明，MS的均数最大（0.451），且1/2MS与MS和KC之间存在显著性差异，但MS和KC间差异不显著P=0.642>0.05，但就均数来看，MS的平均数最大，即对类原球茎的诱导率最高，因此类原球茎的诱导最适宜的基本培养基为MS。2,4-D对‘火鸟’类原球茎诱导率的影响见表6，对其进行差异性配比（表7）。

表 3 类原球茎诱导率方差分析结果Table 3 ANOVA on induction rate of PLBs

表4 基本培养基对诱导率的影响Table 4 Effect of basic medium on induction rate

表 5 基本培养基差异性配比Table 5 Different basic medium composition

由表6、表7表明，2,4-D的浓度为0.2 mg·L-1时均数最大（0.540），且添加0.2 mg·L-1与0.4 mg·L-1和0.8 mg·L-1之间存在显著性差异，0.4 mg·L-1和0.8 mg·L-1之间差异不显著P=0.912>0.05，结合均数，培养基中添加0.2 mg·L-1的平均数最大，表明2,4-D对类原球茎的诱导最适宜的浓度为0.2 mg·L-1。

表 6 2,4-D对类原球茎诱导率的影响Table 6 Effect of 2,4-D on induction rate of PLBs

表 7 2,4-D差异性配比Table 7 Different composition of 2,4-D

2.2 类原球茎的增殖

不同浓度NAA对‘火鸟’类原球茎增殖的影响见表8。

从表8可以看出，与对照组相比，添加不同浓度NAA的类原球茎培养后平均鲜重和平均增殖倍数更大，其生长状态更好，增殖快，聚集成团状，体积较大，分化少。在不同浓度的NAA处理中，以1.0 mg·L-1的增殖效果最好，所培养的类原球茎生长也较好，培养后鲜重、增殖系数分别为7.10，3.55。NAA浓度在0.05 mg·L-1时，

生长状况比1.0 mg·L-1浓度的要差，生长缓慢，颜色暗淡。NAA为2.0 mg·L-1时，后期会导致类原球茎的分化，抑制其增殖，其增殖系数虽然较高，但类原球茎的质量稍差，且生长不均匀，分化出的茎叶比较细弱。说明NAA浓度过低不利于类原球茎的增殖，浓度过高则在后期出现抑制类原球茎的增殖。因此‘火鸟’类原球茎增殖的NAA的适宜浓度为1.0 mg·L-1。

2.3 类原球茎的分化

不同浓度NAA对‘火鸟’类原球茎分化的影响见表9。

表 8 NAA对类原球茎增殖的影响Table 8 Effect of NAA on proliferation of PLBs

表 9 不同浓度NAA对类原球茎分化的影响Table 9 Effect of different NAA concentration on differentiation of PLBs

从表9可知，添加0.5 mg·L-1NAA处理的‘火鸟’类原球茎分化效果明显优于其它处理，与不添加NAA的处理相比，在P＜0.01水平上有极显著差异，而且出苗更多、分化出的芽较健壮，没有徒长现象。试验结果可以看出，随着NAA浓度的提高，类原球茎及分化苗的生长等方面表现出较大的优势，类原球茎和分化苗鲜绿，长势整齐，部分分化苗长出根，培养材料大多聚集，由内向外生长，其中添加0.5 mg·L-1NAA的培养基处理中根与叶片的生长量增加最大。

2.4 ‘火鸟’的生根壮苗

从表10、表11可看出，每个处理都比对照发根数及鲜重多，表明活性炭对‘火鸟’试管苗生根壮苗的促进作用显著。培养基中添加1 g·L-1和0.5 g·L-1活性炭，‘火鸟’试管苗的株高、发根数以及根长在P＜0.05水平上有显著差异。活性炭浓度高于1 g·L-1，试管苗的株高、鲜重、发根、发根数、根重没有显著差异。由此可知添加1 g·L-1活性炭更有利于壮苗和生根，同时实验中发现活性炭能够有效控制褐化现象。

表 10 活性炭对试管苗生根壮苗的影响Table 10 Effect of activated carbon on growth and rooting of in-vitro plantlets

表 11 不同有机添加物对‘火鸟’试管苗生根壮苗的影响Table 11 Effect of different organic additives on growth and rooting of in-vitro plantlets

由表11可知，椰乳与添加其他有机物在株高、根长有显著差异（P＜0.05），分别为4.39 cm和2.20 cm，其叶色浓绿，茎粗节长，根粗壮且整齐。在生根数与生根率方面，4种添加物之间无显著性差异，但从鲜重上比较椰乳与马铃薯汁处理组之间有显著差异。因此椰乳最有利于‘火鸟’壮苗生根培养。

2.5 ‘火鸟’的移栽驯化

不同光照强度对‘火鸟’组培苗移栽驯化的影响见表12。不同温度对‘火鸟’组培苗移栽驯化的影响见表13。

表 12 不同光照强度下‘火鸟’组培苗生长指标Table 12 Growth traits of in-vitro plantlets under different illumination intensity

表 13 不同温度对‘火鸟’组培苗生长的影响Table 13 Growth traits of in-vitro plantlets under different temperature

由表12可知，光照强度1 500 Lx处理组的‘火鸟’组培苗的植株重量、高度，叶片数量分别是光照强度3 000 Lx处理组的2.82倍，2.48倍，3倍，且光照强度3 000 Lx处理组的‘火鸟’植株个体明显瘦弱，生长速度缓慢，甚至出现部分死亡的现象，成活率仅47%。而光照强度2 000 Lx处理组的植株叶片呈绿色，新叶生长相对较多，与1 500Lx处理组仅在植株鲜重增加量存在显著差异。因此1 500 Lx光照对‘火鸟’组培苗驯化效果最佳。

由表13可知，在相同的相对湿度和光照条件下，25℃处理组‘火鸟’组培苗叶片数的增加量和成活率与其他处理组之间存在显著性差异，成活率达86%。25℃处理组植株高度、鲜重与30℃处理组差异显著。试验中观察到30℃处理组的组培苗生长状况不良，植株叶尖部分发黄明显。培养箱温度在25℃条件下，‘火鸟’组培驯化苗新根数量多，且长势良好，最为适宜。

3 结论与讨论

在‘火鸟’类原球茎诱导试验中，类原球茎的诱导最适宜的基本培养基为MS，本试验与修景润等[10]的筛选结果一致。0.2 mg·L-1的2,4-D对类原球茎诱导最适宜，因此合适的培养条件为MS+ 2 mg·L-16-BA +0.5 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-12,4-D。不同浓度NAA的处理，1.0 mg·L-1的增殖效果最佳，且类原球茎生长良好，平均增殖系数为3.55倍，最适培养条件为1/2MS+0.05 mg·L-1KT +1.0 mg·L-1NAA。类原球茎的分化培养以0.5 mg·L-1NAA的效果最好，最适的培养条件为1/2MS + 0.5 mg·L-16-BA + 0.5 mg·L-1NAA。

类原球茎可以通过叶尖、花茎、茎节切段和丛生芽等为外植体进行诱导。诱导类原球茎过程中愈伤、类原球茎和不定芽同时交错存在[11]。本试验用NAA，6-BA和2,4-D对‘火鸟’类原球茎进行诱导，结果表明，2,4-D的作用显著，其次是NAA和6-BA。韩磊等[12,13]认为1/2MS相比MS培养基可减少类原球茎褐化程度，同时1/2MS，0.2 mg·L-1NAA和0.5 mg·L-16-BA有利于其芽分化，但本试验结果是MS对类原球茎的诱导效果最佳，存活率较高，分化效果在0.5 mg·L-1NAA和0.5 mg·L-16-BA处理条件下较好，这与韩磊的研究结果有所差异，可能与基因型差异引起的植物体内源激素水平的不同有关[14]。不同浓度的KT均具有愈伤组织的直接诱导能力，但作用效果不同[15]。试验中发现，低浓度的KT与高浓度的NAA组合有利于‘火鸟’类原球茎的增殖生长。

在兰科植物组织培养过程中添加有机物屡见报道，有机添加物中包含植物生长所需的丰富的营养物质，如蛋白质、硫胺素、核黄素、抗坏血酸、钾、钠、钙、镁、磷等营养成分。研究发现椰乳能促进兜兰不定根的形成[16]，椰乳有利于蝴蝶兰Phalaenopsis aphrodite地上部鲜质量积累[17]，香蕉汁和土豆汁有利于铁皮石斛壮苗生根[18]，添加苹果汁和香蕉汁有利于墨兰Cymbidium sinense生根壮苗[19]。本试验选用这几种常用有机添加物，结果表明椰乳一定程度上促进了‘火鸟’组培苗的生长，与潘虹虹等[20]的研究结果一致。由于培养基中添加椰乳，增加了培养成本，为了降低成本，替代椰乳成分的其它有机添加物有待研究。在生根培养基中加入1g·L-1的活性炭能有效提高生根率并控制褐化现象。光照培养箱光照强度1 500 Lx和培养温度25℃条件更有利于‘火鸟’组培苗移栽驯化，过强的光照和过高的温度，会使‘火鸟’叶片出现发黄，叶绿素遭破坏，成活率降低。

石斛属组织培养的相关研究报道较多，但是由于兰科植物的不同品种之间类原球茎诱导、增殖及芽分化等方面存在较大差异，本试验选用观赏价值较高的 ‘火鸟’，较系统地开展了其组培快繁的研究，初步构建了‘火鸟’组培快繁体系。

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Tissue Culture of Soot Apices for Induction of PLBs of Dendrobium nobile ‘Huoniao’

WANG Ze-qi，MENG Jin-ling，CUI Yong-yi
（1.School of Landscape Architecture, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China; 2. School of Agricultural and Food Science, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China)

Experiments were conducted on induction, multiplication, differentiation and rooting of shoot apices of Dendrobium nobile ‘Huoniao’ as explants treated by different plant growth regulators and basic medium. The results showed that the best basic medium and growth regulator was MS and 0.2 mg·L-1of 2,4-D for induction of protocorm-like bodies(PLBs) with induction rate of 92%. 1.0 mg·L-1of NAA had the best effect of proliferation of PLBs, with growth coefficient of 3.55 time. 0.5 mg·L-1of NAA had the best effect of differentiation of PLBs. Addition of 5% coconut milk and 1.0 g·L-1activated carbon had advantages of rooting and seedling growth. The conclusions for the experiments were as follows, the best condition for induction, proliferation and differentiation was MS +2 mg·L-16-BA + 0.5 mg·L-1NAA +0.2 mg·L-12,4-D, 1/2MS + 0.05 mg·L-1KT + 1.0 mg·L-1NAA, and 1/2MS +0.5 mg·L-16-BA + 0.5 mg·L-1NAA. The survival rate of in-vitro plantlets was 86% under 25℃ and 1 500 Lx light intensity in light incubator.

Dendrobium nobile ‘Huoniao’; tissue culture; shoot apices; protocorm-like bodies

S723.1+32

A

1001-3776（2017）02-0048-07

10.3969/j.issn.1001-3776.2017.02.007

2016-11-05 ；

2017-02-28

浙江省花卉新品种选育重大科技专项( 编号: 2012C12909-11-2)

王泽祺，硕士研究生，主要从事观赏花卉繁殖研究；E-mail：wzq041015@126.com。通信作者：崔永一，博士，教授，主要从事观赏花卉繁殖研究；E-mail：orchidcui@163.com。