不同组织来源间充质干细胞体外成骨分化能力的比较研究

赵刚 刘微微 高伟玮 马洁

天津市康婷生物工程有限公司，天津 300385

骨组织缺损是一种因外伤、肿瘤切除、感染等因素引起的骨质流失从而形成的较大间隙，这一问题在临床较为常见并且较难处理[1,2]。随着骨组织工程技术的不断发展，这一问题得到了一定程度的解决。骨组织工程需要可降解的支架材料和合适的种子细胞。可降解支架材料研究的人员越来越多，取得的成果也十分显著，但是种子细胞的选择一直困扰着研究人员。早期研究人员选用骨细胞和骨基质细胞作为种子细胞，但是这种细胞取材困难，体外增殖能力较弱，不易作为真正的种子细胞[3]。随后，研究人员将骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)作为种子细胞应用于骨组织工程，以此来修复骨缺损，并且取得了一定的成效，但是BMSCs的活力及细胞数量与供体年龄呈负相关，限制了其的应用[4-8]。因此，寻找一种替代BMSCs的细胞势在必行。经研究证实分离培养脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells，ASCs)和脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)的方法简便，分离培养出的细胞在体外具有较强的增殖能力、多向分化潜能以及低免疫原性等优点[9-12]。因此，ASCs和UC-MSCs被认为是骨组织工程中非常有前景的种子细胞。有研究表明，I型胶原(COL I)是骨组织标志性代表因子，ALP是骨再生早期的代表性因子，骨钙素(OCN)是骨再生后期代表性因子，Osterix是骨再生过程调控骨基质形成的转录因子[13-16]。因此，本研究旨在通过对ASCs、BMSCs和UC-MSCs体外成骨能力的研究寻找优势干细胞种类，为骨组织工程修复骨缺损提供一定的数据支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1主要试剂：DMEM/Ham’sF-12、磷酸缓冲液(Hyclone公司)；胎牛血清(百灵公司)；青链霉素(华北制药)；cck-8(上海同仁)；I型胶原酶、胰蛋白酶、碱性磷酸酶试剂盒、茜素红(Sigma)；Trizol(Invitrogen公司)；real-time PCR试剂盒SYBR Premix Ex TaqTMII、反转录试剂盒PrimScriptTMRT Master Mix(TakaRa公司)；CD14-PE、CD34-PE、CD44-PE、CD45-PE、CD90-PE、CD105-PE(BD公司)；Ficoll淋巴分离液(GE公司)，氯化十六烷基吡啶(上海试剂一厂)。

1.1.2组织：脂肪、骨髓和脐带组织，取自天津市中心妇产科医院。

1.2 方法

1.2.1细胞培养：脂肪间充质干细胞的分离培养：获取无菌的脂肪组织，无菌条件下将脂肪组织剪碎，加入0.075%的I型胶原酶，消化90 min；1500 r/min离心5 min，弃上清和未消化的脂肪组织；磷酸缓冲液重悬沉淀，1500 r/min，离心5 min；完全培养液(DMEM/F-12+10%FBS)重悬沉淀，计数，将细胞以1×106/cm2接种至培养瓶中培养，3d后换液，去除未贴壁的细胞。

脐带间充质干细胞的分离培养：获取无菌的脐带组织，无菌条件下剥离脐带组织的外膜和脐带组织内动、静脉，分离出华通氏胶并剪碎至2～3 mm3，将剪碎的华通氏胶组织块贴于培养瓶底面，2 h后向培养瓶内添加适量完全培养液，1 w之后换液。

骨髓间充质干细胞的分离培养：获取无菌的骨髓，用磷酸缓冲液冲洗骨髓，1500 r/min离心5 min，去上清；加入与沉淀等体积的磷酸缓冲液，混合均匀；按照骨髓：Ficoll=1∶1的体积比例，将骨髓缓慢加入Ficoll液面上，2000 r/min离心20 min；吸取间白膜层单核细胞，加入磷酸缓冲液冲洗，1500 r/min离心5 min，弃上清；用完全培养液重悬沉淀，计数，以1×106/cm2的细胞密度接种至培养瓶中进行培养。

上述3种细胞于37℃，5%CO2的培养箱中培养。

1.2.2细胞增殖能力测定：取P3代上述3种MSCs，并以2×103个/孔接种至96孔板，采用CCK8法连续8d测定其吸光值。

1.2.3细胞表型鉴定：取P3代MSCs，待细胞长至80%～90%时，用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA室温消化2 min，1500 r/min，离心5 min；收集沉淀，磷酸缓冲液重悬细胞，过40 μm滤网，制成单细胞悬液，计数，加入FBS进行封闭；弃去FBS，用磷酸缓冲液清洗3次；将细胞制成1×108/L的细胞悬液，取100μL分别加入相应量的PE标记鼠抗人抗体CD14、CD34、CD44、CD45、CD90和CD105，避光40 min，离心，磷酸缓冲液清洗1次；上流式细胞仪进行检测分析。

1.2.4细胞成骨诱导后染色鉴定：取P3代MSC以一定密度接种至6孔板中，次日实验组更换为成骨诱导液(10 mmol/Lβ-甘油磷酸、10-7mol/L地塞米松、50 μg/mL抗坏血酸)，对照组更换为H-DMEM+10%FBS，3 d更换1次成骨诱导液，成骨诱导9d后做碱性磷酸酶染色；3种MSCs成骨诱导后茜素红染色鉴定：茜素红染色后定量分析时，使用氯化十六烷基吡啶溶解钙结节，570 nm处测OD值。

1.2.5细胞成骨诱导后分子水平鉴定：采用Trizol法提取3种MSCs成骨诱导9 d和18 d后细胞RNA，按照反转录试剂盒合成cDNA，然后进行RT-qPCR。引物设计：按照NCBI GenBank的人COL1、ALP、Osterix、OCN和GAPDH的mRNA序列，排除与人其他基因的同源性后设计、合成引物。

表1 3种骨再生相关基因PCR引物Table 1 The PCR primers of osteogenesis-related genes

RT-qPCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s；55退火30 s；72延伸45 s；39个循环。

1.3 统计学处理

图2 3种MSCs增殖曲线Fig.2 The growth curve of the three MSCs cells

图3 3种MSCs的流式检测A:ASC0s，B:BMSCs，C:UC-MSCsFig.3 The flow cytometry analysis of the three MSCs

2 结果

2.1 细胞培养

P3代三种MSCs倒置显微镜下观察到的细胞形态，细胞均呈长梭状，集落式旋涡式生长。

图1 3种MSCs倒置显微镜下观察到的细胞形态(100×)Fig.1 The cell morphology of the three MSCs under phase contract microscope (100×)

2.2 细胞增殖能力比较

3种P3代MSC传代后1～3 d处于潜伏期，此时细胞没有明显的增殖；3～5 d进入对数生长期，此时细胞增殖活跃；5 d之后细胞进入平台期，细胞增殖趋于平缓。

2.3 细胞表型的鉴定

P3代ASCs、BMSCs和UC-MSCs流式鉴定结果，CD14、CD34和CD45表达率均低于1%，CD44、CD90和CD105的表达率均高于97%。

图4 三种MSCs成骨诱导9dALP染色(100×)Fig.4 ALP staining of the three MSCs cells (100×)

图5 3种MSCs成骨诱导18 d茜素红染色(100×)Fig.5 Alizarin red staining of the three MSCs cells (100×)

2.4 细胞成骨诱导后染色鉴定MSCs成骨诱导9 d后染色

2.4.1ALP染色：P3代3种MSCs成骨诱导9d后碱性磷酸酶(ALP)染色，实验组细胞内均有大量成骨分化蛋白ALP表达。

2.4.2茜素红染色：P3代3种MSCs成骨诱导18 d后茜素红染色可以看到实验组有大量矿化钙结节产生(如图5)，BMSCs成骨诱导所形成的矿化钙结节与UC-MSCs无显著性差异，但显著性高于ASCs(如图6)。

2.5 细胞成骨诱导后分子水平比较

2.5.1细胞成骨诱导9 d：P3代3种MSCs成骨诱导9 d后，实验组COLI、ALP和Osterix 3种基因均高表达(如图7)；3种MSCs成骨诱导9 d后，UC-MSC实验组的COLI基因表达显著性高于BMSCs，ASCs和UC-MSCs实验组的ALP基因表达显著性低于BMSCs，ASCs实验组的Osterix基因表达显著性低于BMSCs，UC-MSCs实验组的Osterix基因表达与BMSCs无显著性差异(如图8)。

2.5.2细胞成骨诱导18 d：P3代3种MSCs成骨诱导18d后，实验组COLI、OCN和Osterix 3种基因均显著性高表达(如图9)；ASCs和UC-MSCs实验组的COLI基因表达显著性高于BMSCs，ASCs和UC-MSCs实验组的OCN基因表达显著性低于BMSCs，ASCs实验组的Osterix基因表达与BMSCs无显著性差异，UC-MSCs实验组的Osterix基因表达显著性低于BMSCs(如图10)。

图6 3种MSCs矿化能力的定量分析Fig.6 Quantitative analysis of the mineralization ability in three MSCs*P<0.05 compared with BMSCs group

图7 3种MSCs成骨诱导9d后COLI、ALP和Osterix基因表达Fig.7 The gene expressions of Osterix, ALP, and COL1 in three MSCs induced after 9 days**P<0.01compared with control group

图8 比较3种MSCs成骨诱导9d后COLI、ALP和Osterix基因的表达(P<0.05)Fig.8 Comparison of the gene expressions of COLI, ALP, and Osterix among the three MSCs induced after 9 days*P<0.05 compared with BMSCs

3 讨论

自体BMSCs作为骨组织工程治疗骨缺损的金种子细胞，但是自体BMSCs存在着取材难、易对患者带来二次伤害等不足之处[8,9]。本研究希望通过对不同来源MSCs体外成骨能力的比较，找到一种优势干细胞作为骨组织工程的种子细胞。

本研究通过体外实验，发现3种MSCs细胞均呈长梭型，且细胞呈漩涡式生长；3种MSCs的P3代细胞在3～5 d处于对数生长期，说明3种MSCs在体外增殖方面无显著性差异。通过流式细胞仪检测3种MSCs表面标志物，发现3种MSCs细胞表面均表达CD44、CD90和CD105且表达率均高于97%，说明ASCs和UC-MSCs与BMSCs在细胞表面标志物表达方面无显著性差异，均属于MSCs范畴。进一步通过体外染色实验发现3种MSCs成骨诱导后，实验组细胞内均表达成骨分化蛋白ALP和矿化蛋白。茜素红染色后定量分析发现UC-MSCs和BMSCs在钙结节形成方面无显著性差异。

图9 3种MSCs成骨诱导18 d后COLI、OCN和Osterix基因表达Fig.9 The gene expressions of Osterix, ALP, and COL1 in three MSCs induced after 18 days**P<0.01compared with control group

图10 比较3种MSCs成骨诱导18 d后COLI、OCN和Osterix基因的表达Fig.10 Comparison of the gene expressions of COLI, ALP, and Osterix among the three MSCs induced after 18 days*P<0.05 compared with BMSCs

经研究证实骨再生过程经历了早期和后期两个阶段，ALP是骨再生早期的代表性因子，骨钙素(OCN)是骨再生后期的代表性因子，COL1是骨组织再生过程以及骨组织的代表性因子，Osterix基因是在骨再生过程中调控骨基质的形成[17-21]。本研究采用实时荧光定量PCR法比较3种MSCs经成骨诱导后Osterix、ALP、OCN和COLI基因的表达，比较结果发现3种MSCs实验组的四种与骨再生相关的基因均显著性高表达于对照组。而ASCs和UC-MSCs实验组的ALP和OCN基因的表达显著性低于BMSCs组；但是比较COLI基因的表达，发现ASCs和UC-MSCs较BMSCs显著性高表达；比较Osterix基因的表达，发现成骨诱导9d时，ASCs的Osterix基因较BMSCs显著性低表达，但是成骨诱导18d时，ASCs实验组的Osterix基因较BMSCs显著性高表达；由此说明3种MSCs经成骨诱导后，其成骨再生相关基因表达的时序性存在着一定的差异。由此得出ASCs和UC-MSCs经过成骨诱导后，决定成骨再生相关因子的基因与BMSCs诱导组基因表达趋势相一致，进一步说明ASCs和UC-MSCs可替代BMSCs作为骨组织工程的种子细胞来治疗骨缺损。

本研究将为骨组织工程选择种子细胞提供新的思路，为临床上应用骨组织工程治疗骨缺损提供可靠的数据支持，为骨组织工程更好的治疗骨缺损提供帮助。