经方青娥丸对去势大鼠骨质疏松作用机制的实验研究

王晓燕 常时新 李冠武 周自明 袁军 王乐 宋彦颖 缪宇

1.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海 200437 2.中国中医科学院广安门医院，北京 100053

骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是以骨量降低和骨结构退化为特点，导致骨脆性和骨折风险增加的一种全身性、代谢性骨骼疾病[1]，往往引起脊柱骨和髋骨骨折，具有“四高一低”的特点，即高发病率、高致残率、高病死率、医疗费用消耗高及低生活质量。原发性骨质疏松症主要发生在老年人群中，中老年女性最为常见，尤其是绝经后妇女。本研究选择SD雌性大鼠为研究对象，采用卵巢切除术建立绝经后骨质疏松模型，观察补肾生髓经典方剂青娥丸治疗绝经后骨质疏松症可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 动物

6月龄SPF级雌性SD大鼠60只，体重350±15 g，购置于上海斯莱克实验动物有限公司，饲养于上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院动物实验中心(合格证：SYXK(沪)2006-0001，NO.0069937)。饲养观察室温度：21±2℃，相对湿度：45%-55%，给予标准光照周期(12 h光照/12 h黑夜)。

1.2 分组

将60只SD雌性大鼠根据随机数字法分为4组，即假手术组(SHAM，n=15)，去势对照组(OVX，n=15)，去势青娥丸组(QEW，n=15)、去势雌激素组(E2，n=15)。

1.3 造模

采用卵巢切除术建立绝经后骨质疏松模型：适应环境1周后，采用戊巴比妥钠(剂量为30 mg/kg)腹腔注射麻醉动物。麻醉稳妥后，将动物仰卧位固定于手术台上，电动剃毛器将下腹部剃毛，手术区域皮肤消毒，保持无菌操作。正中部位打开腹腔，拨开肠管找到卵巢，输卵管远端用血管钳固定、结扎，将子宫阔韧带分离，摘除双侧卵巢，将小肠等腹腔器官组织复位，关闭腹腔、对手术切口进行缝合,假手术组只需切除卵巢周围等量脂肪组织即可[2]。

术后即刻予以肌注40万U/kg青霉素，连续5天，每天2次，预防伤口感染。给予12 h光照/12 h黑暗循环，标准鼠笼分笼饲养，自由进食、进水。所有实验鼠术前及术后均称体重。术后密切观察，注意伤口感染征象。

1.4 给药

建模8周后，各组分别进行药物干预。青娥丸组：青娥丸(杜仲、补骨脂、核桃仁、大蒜)，按照9 g/kg临床剂量，根据动物间体表面积折算的等效剂量换算，予56.7 g/kg，每天灌胃两次；雌激素组：给予β-雌二醇0.2 mL/kg药物干预；正常组、假手术组及OVX对照组分别给予等量去离子水。根据每周体重调整药物剂量，共给药12周。动物处死前第14天和第13天皮下注射盐酸四环素、处死前第4天、第3天皮下注射钙黄绿素，进行骨荧光双标记。

1.5 取材

药物干预结束后，次日腹主动脉取血后处死所有动物，剥离胫骨及腰椎，储存于-80 ℃冰箱备用。

1.6 指标检测

1.6.1骨密度检测

双能X线吸收测量仪(dual X-ray absorptionmetry, DXA；Prodigy Lunar, GE Health-care, USA)采用专用动物成像软件(Software Version enCORE 13.40.038)，对实验鼠行全身骨密度扫描，以获取腰椎(L3-L6)和股骨近端感兴趣区骨密度，扫描条件：电压76 kV，电流0.15 mA，扫描时间约4 min，扫描前首先进行质量保证测试，校准标准块由厂家提供，研究期间其测量结果波动在DXA的质控Shewhart图范围内，BMD测量的精确性用变异系数(Coefficient of variation,CV)表示，CV均为0.98%[3]。

1.6.2骨组织形态计量学参数测定

每组动物随机选取8只，于处死前的13 d、14d 和3 d、、4d 分别皮下注射钙黄绿素(8 mg/kg)和盐酸四环素(50 mg/kg)。处死动物后选取胫骨于70%无水乙醇 4℃保存，90%无水乙醇，4天每天换液1次，4℃保存，100%无水乙醇，4天每天换液1次，室温保存，100%无水乙醇，5天每天换液1次，室温真空保存，二甲苯，5天每天换液1次，室温真空保存，二甲苯：UMMA 1∶1，5天每天换液1次，4℃真空保存，UMMA，5天每天换液1次，4℃真空保存，PMMA，待凝固包埋完成(注：使用PMMA包埋时需抽真空，使组织间空气充分去除，补充流失PMMA)，5 μm和10 μm纵向不脱钙骨切片，5 μm切片常规脱蜡至水后甲苯胺染色；10 μm切片用于荧光显微镜下观察。然后利用骨组织形态学测量系统进行指标检测，测量指标有：骨小梁体积百分比(TBV%)、骨小梁吸收表面百分比(TRS%)、骨小梁形成表面百分比(TFS%)、活性生成表面百分比(AFS%)、骨小梁矿化率(MAR)、骨小梁骨生成率(BFR)、类骨质平均宽度(OSW)、骨皮质矿化率(mAR)。

1.6.3ELISA检测血清BALP、CTX-1、E2表达情况

实验前将试剂盒及待测标本放置室温平衡30 min，将标准品和样本各100 μL依次加入孔中，并做好标记，在标准品和样本孔中分别加入50 μL酶联亲和物，充分混匀。37℃温育60 min后弃尽孔内液体，用稀释好的洗涤液反复冲洗5次并扣干孔内剩余液体，每孔按照次序，分别加入显色液，并充分混匀，在室温下避光反应15 min，反应后每孔加入终止液50 μL，充分混匀，终止反应，用酶标仪在450 nm测定OD值。以标准品浓度作为横坐标，OD值作为纵坐标，绘制标准曲线，得出标准方程，根据标准方程计算出每个样本的浓度。

1.6.4统计学处理

采用SPSS 18.0 统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，两两比较采用t检验，符合正态分布和方差齐性采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，如不符合正态分布和方差齐性则采用Kruslal-Wallis H检验。P<0.05被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗前后骨密度值比较

治疗前各组实验鼠股骨和椎骨骨密度值差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。与治疗前比较，OVX组股骨骨密度值显著降低(P<0.01)，椎骨骨密度值也明显降低(P<0.05)，表示造模成功；E2组治疗后股骨和椎骨骨密度值较治疗前均有明显升高(P<0.05)；与治疗前比较，QEW组治疗后股骨和椎骨骨密度值也均有一定程度升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。

部位Location组别Group治疗前Before treatment治疗后After treatment股骨Femur(g/cm2)椎骨Vertebra(g/cm2)Sham(n=8)0.13±0.00 0.13±0.01OVX(n=8)0.12±0.000.08±0.01∗∗E2(n=8)0.12±0.010.13±0.00∗QEW(n=8)0.12±0.01 0.13±0.02Sham(n=8)0.16±0.02 0.17±0.02OVX(n=8)0.15±0.010.12±0.03∗E2(n=8)0.16±0.01 0.17±0.01∗QEW(n=8)0.16±0.010.18±0.02

注：各组治疗前后比较，*P<0.05，**P<0.01
Before and after treatment in each group,*P<0.05，**P<0.01

2.2 骨组织形态计量学参数比较

(1)骨小梁组织形态计量见表2，图1。

组别nTBV(%)TRS(%)TFS(%)MAR(μm/d)Sham823.11±0.584.51±0.224.79±0.431.50±0.14OVX818.35±0.487.19±0.447.73±0.192.44±0.18E2821.67±0.885.91±0.186.18±0.091.68±0.22QEW822.39±0.496.72±0.296.88±0.352.03±0.19

图1 骨小梁组织形态计量Fig.1 Trabecular bone histomorphometry注：*P<0.01，OVX vs.SHAM；#P<0.01，E2 vs.OVX，□P<0.05，E2 vs.SHAM，■P<0.01，E2 vs.SHAM；△P<0.05，QEW vs.OVX，▲P<0.01，QEW vs.OVX，◇P<0.05，QEW vs.SHAM，◆P<0.01，QEW vs.SHAM

采用Qwin V3图像系统进行骨组织形态计量学数据分析，见表3，图3。结果显示：OVX组大鼠胫骨TBV%显著低于SHAM组(P<0.05)；与OVX组比较，QEW组、E2组TBV%均显著升高(P<0.05)，但二组均明显低于SHAM组。OVX组大鼠胫骨TRS%显著高于SHAM组(P<0.05)；与OVX组比较，QEW组、E2组TRS%均显著降低(P<0.05)，但二组均明显高于SHAM组。OVX组大鼠胫骨TFS%和MAR均显著高于SHAM组(P<0.05)；与OVX组比较，QEW组、E2组TFS%和MAR均显著降低(P<0.05)，与SHAM组比较，二组TFS%均明显高于SHAM组，而QEW组MAR显著增高(P<0.05)，E2组则差异无统计学意义(P>0.05)。(见图1)

(2)皮质内表面形态计量

组别nOSW(μm)mAR(μm/d)Sham82.28±0.092.79±0.13OVX83.28±0.194.33±0.26E282.54±0.223.22±0.15QEW82.62±0.512.87±0.57

图2 皮质内表面形态计量Fig.2 Cortical surface morphology measurement注：*P<0.01，OVX vs.SHAM；#P<0.01，E2 vs.OVX，■P<0.01，E2 vs.SHAM；▲P<0.01，QEW vs.OVX

同样，采用Qwin V3图像系统进行骨组织形态计量学数据分析，结果显示：

OVX组大鼠胫骨OSW和mAR均显著高于SHAM组(P<0.05)；与OVX组比较，QEW组、E2组mAR和OSW均显著降低(P<0.05)，与SHAM组比较，E2组mAR和OSW均显著增高(P<0.05)，而QEW组则差异无统计学意义(P>0.05)。(见图2)

2.3 血清骨代谢及雌激素(BALP、CTX、E2)水平见表4-6，图3-5

表4 各组大鼠血清中BALP水平Table 4 The levels of BALP in serum of each group

图3 各组动物血清中BALP水平Fig.3 The levels of BALP in serum of each group注：*P<0.05，vs.SHAM；#P<0.05,vs.OVX

表5 各组大鼠血清中CTX水平Table 5 The levels of CTX in serum of each group

图4 各组动物血清中CTX水平Fig.4 The levels of CTX in serum of each group注：*P<0.01，vs.SHAM；#P<0.01,▲P<0.05 vs.OVX；◆P<0.01,vs.E2

表6 各组大鼠血清中Estradiol水平Table 6 The levels of Estradiol in serum of each group

图5 各组动物血清中Estradiol水平Fig.5 The levels of Estradiol in serum of each group注：*P<0.05，vs.SHAM；#P<0.01,▲P<0.05，vs.OVX；◆P<0.01,vs.E2

综上，与SHAM组比较，OVX组BALP水平显著降低，具有统计学意义；与OVX组比较，E2组和QEW组BALP水平均显著升高，具有统计学意义。与SHAM组比较，OVX组CTX水平显著增高，具有统计学意义；与OVX组比较，E2组和QEW组CTX水平均显著降低，具有统计学意义；QEW组CTX水平显著高于E2组，且具有明显统计学差异。与SHAM组比较，OVX组雌激素水平显著降低，具有统计学意义；与OVX组比较，E2组和QEW组雌激素水平均显著升高，具有统计学意义；QEW组雌激素水平显著低于E2组，且具有明显统计学差异。

3 讨论与分析

传统中医学并没有对绝经后骨质疏松症明确的相关记载，但根据该病的临床症状及体征，可将其归为“痹症”“骨痹”“骨枯”“骨痿”等范畴，其中“骨痿”与之最为相似[4]。如《素问·痿论》云：“肾气热，则腰脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿。”明确指出，“骨枯而髓减”为骨痿的基本发病病机。《素问·上古天真论》曰：“女子七岁，肾气盛，齿更发长；......七七任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通，故形坏而无子也”，《素问·痿论》又云：“腰者肾之府，转摇不能，肾将惫矣”。可见绝经后女性肾气虚弱，天癸枯竭，精亏髓减，髓不养骨，而致筋骨枯弱。因此，我们拟以补肾生髓经典方剂青娥丸以补肾强骨填髓治疗绝经后骨痿。

青娥丸出自《太平惠民和剂局方》，为补肾强骨经典方剂。该方由杜仲、补骨脂、核桃仁组成，加大蒜熬膏，制为丸药，具有良好的补肾、强骨、止痛之效。方中杜仲味甘性温，归肝肾经，《神农本草经》：“主腰脊痛，补中，益精气，坚筋骨”，具有补肝肾、强健骨之效，用以治疗肾虚腰痛及各种腰痛，可达强腰固本之功用，常与补骨脂配伍使用。补骨脂，味苦、辛，性温，归肾、脾经，具有补肾壮阳、固精缩尿、温脾止泻等功效，《本草经疏》：“补骨脂，能暖水脏，阴中生阳，壮火益士之要药也”，善壮肾阳而暖水脏，以治疗肾阳虚证为主，可治肾阳虚弱，风寒侵袭之腰膝冷痛。核桃仁，味甘，性温，归肾、肺、大肠经，具有补肾温肺，润肠通便之效，可治腰膝酸痛、下肢痿弱，因其温补肾阳力弱，多与他药配伍使用。大蒜，味辛，性温，归脾胃、肺经，可解毒消肿。全方共奏补肾强骨生髓之效。

骨密度是量化骨强度的良好指标，但是骨密度并不能精确的计算骨质量[5]。骨组织形态计量学是采用不脱钙硬包埋法和活体荧光标记法制作骨组织标本，得到骨结构和骨重建参数，进而形象而直观地量化和分析松质骨骨微结构，是评价骨转换和骨微结构的重要方法，在骨代谢研究领域中具有重要的应用价值[6]。本课题研究发现：OVX组大鼠胫骨TBV%显著低于SHAM组；与OVX组比较，QEW组、E2组TBV%均显著升高，但二组均明显低于SHAM组；OVX组大鼠胫骨TRS%、TFS%、MAR、OSW和mAR均显著高于SHAM组；与OVX组比较，QEW组、E2组TRS%、TFS%、MAR、mAR和OSW均显著降低，与SHAM组比较，两组TBV%、TFS%均明显高于SHAM组，E2组mAR和OSW均显著增高，QEW组MAR显著增高。胫骨TBV%是骨量水平高低的主要标志，TRS%代表骨吸收，而TFS%、MAR、OSW和mAR则是代表骨形成的主要参数，以上结果表明，QEW均能够提高去势大鼠骨量水平，且能够在一定程度上调节骨转换，对绝经后骨质疏松症具有明显的防治作用。

骨转换标志物是评估骨代谢的生化指标[7]，能够反映药物对骨转换的代谢作用，骨转换增加是绝经后骨质疏松病理生理发展过程中最重要的因素。不同的标志物分别介导骨形成和骨吸收，而二者之间的不平衡通常被认为是导致骨质疏松的重要发病机制。本研究发现：E2组和QEW组BALP水平较OVX组均显著升高，CTX水平较OVX组均显著降低；QEW组CTX水平显著高于E2组，且具有明显统计学差异。青娥丸能够使骨转换速率下降，具有预防骨量丢失的作用。

由于雌激素水平的下降，大多数骨质疏松症患者为绝经后女性。女性与年龄相关的骨流失分为两个阶段：第一个阶段始于绝经，主要表现在骨小梁上，由于雌激素缺乏引起，并导致与骨形成相比骨吸收不成比例的增加，4-8年后该阶段达到顶峰；第二阶段开始，表现为骨小梁和骨皮质持久的、缓慢的损耗，主要是由骨形成下降引起的。研究结果显示：E2组和QEW组雌激素水平较OVX组均显著升高，而QEW组雌激素水平显著低于E2组，且具有明显统计学差异。研究结果表明，青娥丸可能具有植物雌激素样作用，能够改善雌激素缺乏所致的骨衰败。

综上所述，青娥丸治疗肾虚型绝经后骨质疏松症，可能与其能够改善骨微结构，调节骨代谢、雌激素样作用等机制相关。