髋骨性关节炎滑膜组织中钙结合蛋白(S100A12)的表达及意义

代凤雷 孙强 张斌 金雯 陈荣国 钱建吉

1. 扬州大学医学院附属六合医院骨科，南京 211500 2. 南京市第一医院骨科，南京 210006 3. 扬州大学医学院附属六合医院病理科，南京 211500 4. 南京市中医院骨伤科，南京 210006

髋骨关节炎(osteoarthritis，OA) 是一种由多种因素引起的老年人的慢性退行性骨关节疾病，是最常见的关节炎类型之一。髋骨关节炎的病理机制尚不完全清楚，近年来大量研究发现，致炎物质及免疫因子与骨关节炎症密切相关。在OA 的早期, 滑膜的增生和纤维化, 分泌炎症介质和软骨降解酶, 可能是OA 发病的重要因素, 随着OA 的进一步发展, 滑膜始终参与其病理过程。钙结合蛋白(S100A12)在多种炎性反应中如类风湿关节炎，溃疡性结肠炎和多种肿瘤等都有高的血清反应[1-4]，是与多数炎症疾病相关的蛋白。在本研究中，我们的目的是检测钙结合蛋白S100A12在髋关节骨性关节炎滑膜组织中的表达，并分析其与髋骨性关节炎严重程度的相关性，以评估它在OA的发病中的作用。

1 材料和方法

1.1 对象

2014年6月至2016年4月，我院联合南京市第一医院骨科收治的行关节置换的髋骨性关节炎患者为实验组(OA组)， 共27例，男15例，女12例，平均年龄61岁；对照组为外伤所致股骨颈骨折患者35例，男21例，女14例，平均年龄59岁。股骨颈骨折均行关节置换手术，术前结合病史及影像学检查排除骨性关节炎病变。两组患者术前行髋关节X线及CT检查，明确诊断。纳入患者得到患者本人同意及医院伦理委员会批准。参照美国风湿病学会1995年提出的诊断标准：①近1月反复髋关节疼痛；②血沉≤ 20 mm/h；③ X 线片示骨贅形成，髋臼缘增生；④ X 线片示髋关节间隙狭窄。满足①+②+③条或①+③+④条者可诊断髋关节退行性骨关节炎。对OA组患者的髋关节X片分析，根据Kellgren-Lawrence(K-L)分期标准，将27例OA组患者划分： 3 级16 例，4 级11 例。排除标准：其他原因导致的髋关节病变如类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、感染等；治疗前2 w内使用过糖皮质类固醇激素的患者；半年内行关节腔内注射；合并严重的系统疾病以及神经、精神障碍者。

1.2 方法

血清标本的采集: 患者禁食12 h，取静脉血，除送检血常规、ASO、RF、CRP外，4℃下2000 g 离心10 min后取上清贮存于-80℃冰箱内备用。手术标本的采集：髋关节置换术中暴露关节滑膜，按同一规格，同一部位，切取0.5 cm0.5 cm滑膜，生理盐水反复冲洗标本表面血迹后放入消毒冻存的EP管内，-80℃冰箱保存备用；免疫组化测定标本立即放入4%多聚甲醛液固定, 经脱水、透明、石蜡包埋, 免疫组化备用。

ELISA 试剂盒为S100A12 Elisa 试剂盒及S100A12多克隆抗体由美国Abnove 公司提供，BCA 试剂盒、裂解液及二抗由南京碧云天生物技术研究所提供。

ELISA法测血清S100A12含量：S100A12浓度的定量测定采用酶联免疫吸附法(ELISA)，使用ELISA试剂盒并按试剂盒说明书执行(S100A12/EN-RAGE ELISA Kit，Cat no: KOA091 V.04，美国Abnove 公司)。S100A12 蛋白标准液用前24h内配制；取0.1 mL的蛋白标准工作液于孔板中；0.1 mL 样品稀释液于“0”孔中，做空白对照；取样品上清50 μL 加入50μL 的样品稀释液于空的孔中；加盖，37℃，90 min，孵育；孵育结束，去掉孔板上的液体；取0.1 mL 抗体工作液于每孔中，37℃，60 min，孵育；PBS 洗板3 次，去掉液体；取0.1 mL 稀释后的ABC 工作液于每孔，37℃，30 min，孵育。PBS洗板5 次，去掉孔板上的液体；加入90 μL TMB显色液，37℃，30 min，孵育；加100 μL TMB 终止液于每孔中，30 min内酶标仪(美国BIO-RAD公司)测定A450的OD值。根据标准曲线计算出样品的蛋白含量。实际S100A12 浓度应为测试结果乘以稀释倍数。

ELISA法测滑膜组织S100A12含量：将滑膜组织标本自然解冻后，切成细小的碎片，置于离心管中，向每个离心管中加入200 μL的预配置的裂解液，冰上裂解1h，组织匀浆离心(10000 g，4℃，15 min)，取上清。BCA法测定总蛋白的含量，操作步骤严格按照试剂盒说明。反应结束半小时内酶标仪测定A562的OD值。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。ELISA测滑膜组织S100A12含量，步骤按试剂盒说明严格执行；加终止液后30 min内酶标仪测定A450的OD值，根据标准曲线计算出样品的蛋白含量。计算每一总蛋白浓度中S100A12含量，单位为ng/mg总蛋白。

免疫组化标本的采集及染色：蜡块3 μm连续切片，采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法 (streptavidin-perosidase，SP) 法进行免疫组化染色。常规二甲苯脱蜡、梯度酒精水化。3% H2O2清除内源性过氧化物酶，置于pH6.0的柠檬酸钠修复液，微波加热修复；10%正常山羊血清封闭，室温20 min，甩去多余液体；加入一抗，4℃过夜，用PBS缓冲液代替抗体作空白对照；生物素标记的二抗孵育；加辣根酶标记链霉卵白素原液(1∶300)，孵育30 min。DAB显色30 min。常规苏木素复染，梯度酒精、二甲苯脱水透明，中性树胶封片，光镜下观察，拍照(×400)。结果判定标准：阳性细胞指细胞质或细胞膜内出现棕黄色颗粒。每张切片在显微镜下随机选择5个高倍视野，染色程度进行半定量分析，采用Image Pro Plus 6.0(IPP)软件对片进行灰度分析，计算阳性反应的平均光密度值(mean optic density，MOD)，MOD=积分光密度/面积。

1.3 统计学处理

2 结果

OA组患者年龄(61.9±6.34)岁和对照组(59.6±14.7)岁之间无显著的年龄差异(P=0.18)，两组之间性别差异不显著(P=0.80)。见表1。

独立样本T检验，OA组的血清中S100A12水平(94.20±49.85)ng/mL显著高于对照组含量(25.32±16.87)ng/mL，差异有统计学意义(P<0.01)。滑膜组织OA组与对照组S100A12含量分别为(3.73±1.97)ng/mg总蛋白和(1.67±1.21)ng/mg总蛋白(P<0.01)，差异有统计学意义。

OA组K-L分级4级患者的血清中S100A12水平(104.81±46.68)ng/mL显著高于3级血清含量(86.85±52.46)ng/mL，有统计学差异(P<0.01)。4级患者滑膜组织含量(4.62±1.95)ng/mg总蛋白显著高于3级患者水平(3.13±1.82)ng/mg总蛋白(P<0.01)。4级患者滑膜组织MOD (0.23±0.06)高于3级患者MOD(0.20±0.06)，但无显著统计学意义(P=0.30)。

免疫组化分析S100A12表达水平，阳性反应在微血管内中性粒细胞胞浆中，以及部分滑膜细胞的胞浆内。两组S100A12 均表达，OA组平均光密度MOD(0.21±0.06)较对照组MOD(0.13±0.05)有显著性差异(P<0.01)。免疫组化图片见图1，2。

使用Pearson 相关分析滑膜组织含量与血清含量无显著相关性(r=0.378，P=0.083)；滑膜组织含量与免疫组化MOD显著正相关性(r=0.43，P=0.048)，但相关关系不密切。血清含量与免疫组化MOD无显著相关性(P>0.05)。

表1 OA组与对照组一般情况比较±s)Table 1 Comparison of general data between OA and ±s)

图1 OA组滑膜免疫组化Fig.1 Immunohistochemical results in OA group

图2 对照组免疫组化Fig.2 Immunohistochemical results in control group

3 讨论

S100A12是近年来新发现的一种促炎因子，参与机体的免疫防御和炎症反应，在炎症发应中起关键作用，具有调节细胞生长分化、生长抑制、并诱导细胞凋亡等[5]。促炎因子S100A12钙结合蛋白家族中的一员，与钙离子的亲和力较高，在其他炎症介质刺激后，发生蛋白构象的改变，由此暴露靶蛋白结合位点，能够与特异性的蛋白或肽类结合，发挥生物学功能。这些钙结合蛋白控制一些关键细胞通路，如细胞骨架，细胞的迁移与粘附，主动氧化防御，参与伤口的愈合，炎性细胞的激活、化学趋化和抗微生物作用，代谢性及肿瘤性疾病的病理生理过程[6,7]。

髋关节骨性关节炎是一种老年患者常见病，髋关节是人体主要的负重关节，容易劳损，多见于体重肥胖的老年人。该病起病缓慢，病程长，临床表现为关节肿胀、关节疼痛、功能障碍，行走困难，严重影响了老年人的生活质量。髋骨关节炎的风险因素众多，包括年龄、负重改变及外伤等。然而，其发病机制仍然不明确。

滑膜组织是指位于关节腔、滑液鞘及滑液囊腔最内面的内衬膜状结构，其主要作用被认为是产生滑液, 降低关节、肌腱、肌肉活动过程中的摩擦阻力。虽然并非所有的OA 发病都与滑膜炎有关，但慢性滑膜炎的产生，可能是促进OA 进行性发展的关键环节，对滑膜组织病理的深入研究发现，关节滑膜分泌的炎性介质如金属蛋白酶(MMP)、肿瘤坏死因子-A(TNF-A)、白细胞介素-1(IL- 1)、细胞间黏附分子-1(ICAM- 1)等可能参与了OA 的整个病变过程[8-9]。

本实验研究显示，髋关节OA患者血清及滑膜组织中的S100A12含量显著高于对照组，说明S100A12对髋关节OA患者发病有重要影响。关节外组织及血液中分泌的S100A12进入血液循环系统，到达OA患者的关节周围组织如滑膜，促进滑膜炎的产生；血液的中性粒细胞分泌的S100A12并未完全通过滑膜进入关节液，可能在转运过程中受到滑膜屏障的限制。免疫组织化学检测显示，S100A12阳性染色不仅存在于滑膜组织细胞中，也存在于OA患者滑膜的微血管中，说明S100A12可以由关节外组织分泌经血液循环，通过滑膜屏障作用于关节软骨，也可以在滑膜组织自身分泌，近距离更直接的发挥作用。

通过血液滑膜组织S100A12表达量的比较，S100A12经血液系统作用于关节比滑膜组织自分泌更有意义。进一步说明骨性关节炎是一种系统性疾病，其发生发展是关节自身损害与全身各系统病变相互作用的结果。

本实验存在一定缺陷，实验组髋OA患者较少，因为是临床试验，缺少健康对照组；髋骨性关节炎OA患者多为老年人，基础病较多，对纳入试验的患者，不能将关节外病变完全排除，系统性疾病对检测结果应有一定的影响；缺少对患者骨性关节炎的严重程度评级，不能完全说明S10012含量的变化对病情严重程度的相关性；缺少治疗前后的检测对比。

综上所述，滑膜组织的S100A12的检测对OA的诊断的灵敏度高于血清检测。由于在多种疾病进程中S100A12被发现，如类风湿性关节炎、克罗恩肠炎、银屑病、胰腺炎、肿瘤、肺炎，以及某些自身免疫性疾病，所以血清检测S100A12对OA的诊断缺少特异性[10,11]。因此通过滑膜检测S100A12，可将关节外病变对S100A12含量变化的影响降低，进而提高灵敏度；S100A12含量的检测对早期诊断OA，评估OA的进展有益[12,13]。S100A12在OA患者的滑膜中表达；并且S100A12的表达与患者骨关节炎严重程度成正相关； S100A12的检测有助于骨性关节炎的早期诊断，提示病变严重程度，为临床治疗提供参考。