不同检测方法在结核性脑膜炎诊断中的应用价值

王娟娟++++++马利

[摘要] 目的 探討外周血T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）、脑脊液结核分枝杆菌培养及结核菌素试验（PPD试验）在结核性脑膜炎诊断中的应用价值。 方法 选择2015年1月～2016年12月延安大学附属医院收治的疑似结核性脑膜炎患者65例为研究对象，所有患者均行外周血T-SPOT.TB、脑脊液结核分枝杆菌培养及PPD试验。观察比较3种检测方法的在结核性脑膜炎诊断中的灵敏度、特异度等。 结果 65例患者中，35例为结核性脑膜炎患者，30例为非结核性脑膜炎患者。结核性脑膜炎患者中，T-SPOT.TB阳性率为74.29%，明显高于结核分枝杆菌培养及PPD试验的阳性率（40.00%，57.14%），且PPD试验阳性率高于结核分枝杆菌培养，差异有统计学意义（P < 0.05）。在非结核性脑膜炎患者中，PPD试验阳性率为26.27%，明显高于T-SPOT.TB及结核分枝杆菌培养的阳性率（10.00%，0.00%），差异有统计学意义（P < 0.05）。在结核性脑膜炎诊断中，T-SPOT.TB的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为89.66%、75.00%、74.29%、90.00%，均明显高于PPD试验的71.43%、59.46%、57.14%、73.33%，差异有统计学意义（P < 0.05）；T-SPOT.TB在结核性脑膜炎诊断中的特异度、阳性预测值均高于结核分枝杆菌培养的52.63%、40.00%，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 外周血T-SPOT.TB检测在结核性脑膜炎诊断中具有较高的敏感度、特异度，有助于结核性脑膜炎的快速诊断，值得临床推广。

[关键词] 结核性脑膜炎；外周血；T细胞斑点试验； 结核分枝杆菌培养；结核菌素试验；诊断

[中图分类号] R529.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）06（a）-0119-04

Application value of different testing methods in the diagnosis of tuberculous meningitis

WANG Juanjuan MA Li▲

Department of Neurology， Yan 'an University Affiliated Hospital， Shaanxi Province， Yan'an 716000， China

[Abstract] Objective To explore the application value of peripheral blood T-SPOT.TB， cerebrospinal fluid mycobacterium tuberculosis culture and tuberculin test （PPD test） in the diagnosis of tuberculous meningitis. Methods 65 cases of patients suspected tuberculous meningitis from January 2015 to December 2016 in Yan 'an University Affiliated Hospital were chosen as the research objects. All patients were given the test of peripheral blood T-SPOT.TB， cerebrospinal fluid mycobacterium tuberculosis culture and PPD test. The sensitivity， specificity in the diagnosis of tuberculous meningitis were compared among the three testing methods. Results Among 65 patients， there were 35 cases with tuberculous meningitis and 30 cases with non-tuberculous meningitis. In patients with tuberculous meningitis， the positive rate of T-SPOT.TB test was 74.29%， and it was significantly higher than that of mycobacterium tuberculosis cultivate and PPD test （40.00%， 57.14%）， and the positive rate of the PPD test was higher than that of mycobacterium tuberculosis culture， with statistically significant differences （P < 0.05）. In patients with non-tuberculous meningitis， the positive rate of PPD test was 26.27%， which was significantly higher than that of T-SPOT.TB and mycobacterium tuberculosis culture （10.00%， 0.00%）， with statistically significant differences （P < 0.05）. In the diagnosis of tuberculous meningitis， the sensitivity， specificity， positive predictive value， negative predictive value of T-SPOT.TB was 89.66%， 75.00%， 74.29%， 90.00% respectively， which were significantly higher than 71.43%， 59.46%， 57.14%， 73.33% of PPD test， with statistically significant differences （P < 0.05）； the specificity and positive predictive value of T-SPOT. TB were higher than those of the mycobacterium tuberculosis culture （52.63%， 40.00%）， with statistically significant differences （P < 0.05）. Conclusion Peripheral blood T-SPOT.TB test in the diagnosis of tuberculous meningitis has high sensitivity and specificity， which is helpful for the rapidly diagnosing tuberculous meningitis. It is worthy of clinical promotion.

[Key words] Tuberculous meningitis； Peripheral blood； T cells spot test； Mycobacterium tuberculosis culture； Tuberculin test； Diagnosis

结核性脑膜炎是由结核分枝杆菌引起脑膜、脊膜的非化脓性炎症性疾病，是临床上最为常见、严重的肺外结核，具有较高的致死率高和致残率。结核性脑膜炎多起病隐匿，病程较慢，但也有部分患者起病较急，早期临床表现较轻，但随着颅内压的增高，患者常常表现出严重的脑膜刺激症状和颅内压增高表现，如头痛、呕吐和视乳头水肿，严重时出现去脑强直发作或去皮质状态，因此早期诊断并给予及时治疗尤为重要。目前结核性脑膜炎的诊断主要根据患者是否有其他部位的结核病史或结核接触史、具有典型的临床症状及体征、实验室检查。但是也有部分患者并无结核病史或结核接触史，且没有典型的临床表现，因此，早期诊断仅依赖于实验室检查。目前临床上常见的检测方式有结核菌素实验（PPD实验）、脑脊液涂片、染色、镜检，以及外周血血象和影像学检测等[1-4]。然而，大量研究结果显示，PPD实验的敏感度并不高，甚至存在一定的假阳性率[5-6]，因此临床上仅将其作为辅助诊断手段。在脑脊液标本中直接检出抗酸杆菌以及采用常规的培养方法分离出结核分枝杆菌仍然被认为是结核性脑膜炎实验诊断的“金标准”。然而由于结核性脑膜炎多见于1～3岁的小儿，腰穿抽取脑脊液极为困难，且即使是成年人，脑脊液的获取量也十分有限，且检测结果还受细菌数量的影响，因此外周血T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）的出现为结核性脑膜炎提供了一个新的诊断途径，其在结核病诊断中的价值已在大量临床研究中[7-10]得到证实。本研究选择延安大学附属医院（以下简称“我院”）近两年来收治的结核性脑膜炎疑似病例进行研究，分析目前临床上常用的几种实验室检测方法的诊断价值，现将研究结果报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2015年1月～2016年12月我院收治的疑似结核性脑膜炎患者65例为研究对象，男41例，女24例；年龄15～65岁，平均（39.5±19.7）岁；病程1～40 d，平均（17.2±6.9）d。纳入标准：患者均表现为头痛、呕吐、发热、易激惹、颈项强直、癫痫、局部神经损害表现、意识改变、昏睡等临床症状和体征。排除标准：其他病毒、细菌、真菌感染所致的中枢神经系统疾病，有腰穿禁忌证，3个月内接受过抗结核治疗。

1.2 诊断标准

结核性脑膜炎的临床诊断标准[11]：具有以下1项或多项结核性脑膜炎的症状或体征：头痛、呕吐、发热、易激惹、颈项强直、癫痫、局部神经损害表现、昏睡、意识改变。患者应满足A或B标准：其中，A为具有典型的症状或体征的同时至少符合以下条件的1项：脑脊液中分离培养到结核分枝杆菌，脑脊液中镜检到抗酸杆菌，PCR法检测到结核分枝杆菌；B为有疑似症状或体征及脑脊液改变同时在其与结核病组织学改变一致的脑或脊髓中镜检到抗酸杆菌，或肉眼可见的脑膜炎（尸检时）。其他非结核性脑膜炎的诊断参考第7版《神经病学》[12]。

1.3 检测方法

入院后，所有患者都分别接受PPD实验、外周血T-SPOT.TB检测以及腰穿抽取脑脊液进行结核分枝杆菌培养。

1.3.1 PPD实验 卡介菌纯蛋白衍生物的稀释剂（50 U/mL，成都生物制品研究所）。于患者左前臂掌侧下1/3处，皮内注入上述稀释液0.1 mL，48～72 h后检查注射部位反应，测量浸润硬结横径及垂直径的平均值，浸润硬结平均直径<5 mm为阴性，≥5 mm为阳性。

1.3.2 T-SPOT.TB检测 检测人外周血抗凝全血中的结核特异抗原刺激活化的效应T细胞，根据T-SPOT.TB试剂盒（Oxford Immunotec Oxford UK）说明书进行操作。使用肝素抗凝管采集患者外周静脉血5～10 mL，密度梯度离心法分离外周血单个核细胞。在已包被抗体的微量板的4个孔中，分别加入阴性对照细胞培养液、阳性对照植物血凝素、抗原A（早期分泌性靶抗原6，ESAT-6）以及抗原B（滤液培养蛋白10，CFP-10）。每孔加入外周血单个核细胞后置于培养箱37℃温育16～20 h后，从培养箱中取出后去除细胞培养液，恢复至室温；采用磷酸盐缓冲液（PBS）反复洗涤5次，采用PBS 200倍稀释浓缩标记抗体试剂；每个反应孔加入500 μL辣根过氧化物酶标记的链霉菌卵白素，在37℃孵育1 h，后弃标记抗体工作液，PBS反复洗涤5次，每个反应孔加入ACE底物显色溶液50 μL后室温孵育7 min；采用去离子水彻底洗涤培养板终止反应，室温干燥培养板，记录每个反应孔内深蓝色清晰斑点数目。阳性判断标準：阴性对照孔斑点数≤5个，检测孔A或检测孔B斑点数≥6个，判断为阳性；阴性对照孔斑点数≥6个，检测孔A或检测孔B斑点数≥2倍阴性对照孔斑点数，判断为阳性。反之均为阴性。

1.3.3 脑脊液结核分枝杆菌培养 腰穿后留取脑脊液1～2 mL进行结核菌快速培养，采用BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌培养鉴定/药敏仪（美国BD公司生产）进行结核菌培养及药敏试验，将脑脊液严格按照MGITTM Procedure Manual要求进行培养，若满8周仍无菌生长即报告培养阴性。

1.4 观察指标

比较T-SPOT.TB试验、结核分枝杆菌培养、PPD试验的阳性检出率。比较T-SPOT.TB试验、结核分枝杆菌培养、PPD试验在结核性脑膜炎中的诊断价值，计算灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。敏感度=真阳性/（真阳性+假阴性）×100%；特异度=真阴性/（假阳性+真阴性）×100%；阳性预测值=真阳性/（真阳性+假阴性）×100%；阴性预测值=真阴性/（真阴性+假阳性）×100%。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3种方法检测情况比较

65例结核患者中结核性脑膜炎35例，非结核性脑膜炎30例。30例非结核性脑膜炎中化脓性脑膜炎11例，隐球菌性脑膜炎3例，病毒性脑膜炎13例，梅毒性脑炎3例。比较3种方法对结核性脑膜炎及非结核性脑膜炎患者的诊断情况，结核性脑膜炎患者中，T-SPOT.TB阳性率明显高于结核分枝杆菌培养及PPD试验阳性率，PPD试验阳性率高于结核分枝杆菌培养，差异有统计学意义（P < 0.05）。在非结核性脑膜炎患者中，PPD试验阳性率明显高于T-SPOT.TB及结核分枝杆菌培养的阳性率，差异有统计学意义（P < 0.05）。提示PPD试验的假阳性率较高，其次为T-SPOT.TB，结核分枝杆菌培养最低。

2.2 3种方法在结核性脑膜炎中的诊断价值

T-SPOT.TB在结核性脑膜炎诊断中的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值均明显高于PPD试验，差异有统计学意义（P < 0.05）；T-SPOT.TB在结核性脑膜炎诊断中的特异度、阳性预测值高于结核分枝杆菌培养，差异有统计学意义（P < 0.05），虽敏感度及阴性预测值低于结核分枝杆菌培养，但差异无统计学意义（P > 0.05）。

3 讨论

结核性脑膜炎不仅具有较高的死亡率还极易与其他中枢神经系统感染相混淆，如化脓性脑膜炎、隐球菌性脑膜炎、病毒性脑膜炎、梅毒性脑炎等，因此误诊率极高。临床上常用的脑脊液涂片镜检或培养结核杆菌，其阳性检出率较低，且对于合并有其他疾病免疫力低下或服用免疫抑制剂的患者，极有可能出现假阳性结果，因此寻找高敏感性和高特异性的诊断方法显得尤为重要。

ESAT-6/CFP-10融合蛋白是结核分枝杆菌复合群基因RD-l区域的结核特异性蛋白抗原，该区只存在于结核分枝杆菌复合群和少数致病性分枝杆菌基因组中，为结核分枝杆菌及少数非结核分枝杆菌所特有的T细胞刺激抗原，可针对细胞上的刺激，产生INF-γ，且在诊断结核性疾病时不受是否接种卡介苗的影响[13]。因此，两种抗原多肽制备的联合应用可提高检测的敏感性及特异性。基于以上原理的T-SPOT.TB技术是目前最敏感的检测结核抗原特异性T淋巴细胞的技术，即应用酶联免疫斑点法或酶联免疫吸附法定量检测全血或外周血中特异性T细胞在特异性抗原的刺激下产生的特异性INF-γ[14-15]。主要适用于2～3周以上不明原因发热患者的结核病筛查、免疫力低下或合并HIV感染的肺外結核患者的诊断，及接种过卡介苗人群的结核病筛查，该项检测技术既简单快捷，同时也避免了因免疫功能受损而导致的假阳性率。有报道显示，T-SPOT.TB诊断肺结核的敏感度为94.1%[16]。甘路民等[17]将该项技术应用于结核性脑膜炎的诊断中，结果发现T-SPOT.TB试验诊断结核性脑膜炎的敏感性为87.18%，特异性为87.80%，优于PPD试验。

本研究发现，结核性脑膜炎患者中，T-SPOT.TB阳性率为74.29%，敏感度为89.66%，特异度为75.00%，阳性率及特异度均明显高于结核分枝杆菌培养及PPD试验，敏感度高于PPD试验，进一步肯定了T-SPOT.TB在结核性脑膜炎诊断中的价值，与既往的研究结果一致[18-22]。此外，张秀英等[23]对不同的检测样本进行比较，结果显示结核性脑膜炎患者脑脊液ELISPOT试验的阳性检出率高于外周血，且脑脊液ELISPOT试验的特异度高于外周血，可见受感染组织的ELISPOT试验较单纯外周血检测对诊断活动性结核病有更具特异性。本研究中，因取材较为困难，仅对采集的脑脊液进行了结核分枝杆菌培养，但阳性检测率并不高，考虑可能是由样本本身含菌量较少所致。然而外周血T-SPOT.TB检测弥补了这一不足，本研究中结核性脑膜炎患者的阳性检出率为74.29%，对于脑脊液结核菌培养阴性的患者提供了有效而简捷的诊断方式[24-25]。

综上所述，外周血T-SPOT.TB检测在结核性脑膜炎诊断中具有较高的敏感度、特异度，且检测方法简单、快速，有助于结核性脑膜炎的快速诊断，值得在临床上推广应用。

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（收稿日期：2017-02-25 本文编辑：程 铭）