斑蝥酸钠维生素B6对人成骨肉瘤细胞凋亡及存活素表达的影响

康肖++扈文海++裴世深++王清和++刘璞++李士学

[摘要] 目的 研究斑蝥酸钠维生素B6诱导MG-63细胞凋亡的作用机制。 方法 应用不同浓度的斑蝥酸钠维生素B6作用于MG-63细胞，用MTT比色法检测药物对细胞的增殖抑制作用；反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测存活素信使核糖核酸的表达。 结果 斑蝥酸钠维生素B6在抑制MG-63细胞增殖方面有显著作用，其作用具有时间和剂量依赖性，抑制率可高达（68.56±5.21）%。RT-PCR显示可下调survivin基因表达。 结论 斑蝥酸钠维生素B6抑制MG-63细胞增殖效果明显，其机制可能与下调survivin基因的表达有关。

[关键词] 斑蝥酸钠维生素B6；MG-63；细胞凋亡；存活素

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）06（a）-0016-04

Effects of Sodium Cantharidate and vitamin B6 on apoptosis and survivin expression in human osteosarcoma cells

KANG Xiao1 HU Wenhai2 PEI Shishen1 WANG Qinghe1 LIU Pu1 LI Shixue1

1.The Third Department of Orthopedics， Hengshui Fourth People's Hospital， Hebei Province， Hengshui 053000， China； 2.Department of Bone Oncology， the Third Hospital of Hebei Medical University， Hebei Province， Shijiazhuang 050051， China

[Abstract] Objective To study the mechanism of Sodium Cantharidate and vitamin B6 inducing apoptosis of MG-63 cells. Methods The different concentrations of Sodium Cantharidinate and vitamin B6 were applied in MG-63 cells， the anti-proliferative effect of drug for cells was detected by MTT colorimetry； reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） was used to detect the expression of survivin messenger RNA. Results Sodium Cantharidate and vitamin B6 could inhibit the proliferation of MG-63 cells in a time and dose-dependent manner， and the inhibition rate could be as high as （68.56±5.21）%. RT-PCR showed downregulation of survivin gene expression. Conclusion The inhibitory effect of Sodium Cantharidate and vitamin B6 on the proliferation of MG-63 cells is obvious， and the mechanism may be related to down regulation of the expression of survivin.

[Key words] Disodium Cantharidinate and Vitamin B6； MG-63； Cell apoptosis； Survivin

成骨肉瘤在臨床上作为病死率极高的原发恶性肿瘤，具有局部呈侵袭性生长和早期易转移的特点，在形成过程中能形成骨组织及其骨样组织。该病的主要发病人群集中于10～30岁，且以男性患者居多，发病部位集中于股骨远端、胫骨与肱骨近端，该病发展迅速，会出现局部跳跃灶，临床上经常出现肺部转移、骨转移等。因此早发现早治疗尤为重要，临床症状主要表现为疼痛与软组织肿块，伴随着抗肿瘤药物的研发与应用，科研工作者发现从斑蝥中提取的有效成分斑蝥素，对于多种恶性肿瘤均有治疗作用[1-2]。最新研究证实斑蝥素和它的衍生物对肝癌、肺癌、卵巢癌以及结肠恶性肿瘤等具有良好的抗癌治疗作用，并且在临床抗肿瘤治疗中获得广泛的应用[3-4]，但是斑蝥酸钠作用于人骨肉瘤细胞诱导MG-63细胞凋亡方面罕见相关报道。本研究以MG-63细胞株作为研究对象，研究斑蝥酸钠维生素B6在诱导MG-63细胞凋亡过程中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 骨肉瘤MG-63细胞株（由河北省骨科医院细胞实验室提供）。

1.1.2 药品与试剂 斑蝥酸钠维生素B6（贵州柏强制药股份有限公司生产，批准文号：国药准字H20053863）；二甲基亚砜（DMSO）（天津永大化学试剂）；MTT（美国Sigma）；Trizol试剂（Invitrogen公司）；PCR引物[生工生物工程（上海）股份有限公司]。

1.1.3 仪器 倒置相差显微镜（LH50A型），日本Olympus公司；全自动酶标分析仪（Biocell-HT2），奥地利Anthos公司；PCR扩增仪（PE9600），美国ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 培养细胞 用人骨肉瘤细胞培养基来培养MG-63细胞。在37℃、5%CO2培养箱进行培养。在试验用倒置显微镜下来观察MG-63生长状态，在MG-63生长呈70%～80%融合状态时，用0.25%胰蛋白酶进行消化传代，每隔1 d换培养液，每隔3、4 d传代1次。

1.2.2 MTT方法测定细胞的增殖 将对数生长期的MG-63细胞数调整为1×105/mL，接种于96孔培养板内，于培养箱中进行培养，24 h后，将各孔内培养基吸出，加入药物浓度为0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 μg/mL斑蝥酸钠维生素B6的培养基，设置空白对照组，培养24、48、72 h，在结束前4 h，将10 μL MTT（浓度为5 mg/mL）加入培养孔内，继续在培养箱内培养4 h，弃上清液，各培养孔中加入10%二甲基亚砜150 μL，用振荡器震荡10 min，应用全自动酶标仪检测培养孔内的光密度值（OD），以492 nm為检测波长（参考波长620 nm）。测算不同药物浓度对MG-63生长的抑制率。抑制率=（1-实验组光密度值/对照组光密度值）×100%。

1.2.3 细胞的形态学的变化 将对数生长期的MG-63细胞数调整为1×104/mL，接种于3块6孔培养板内，每孔注入量为3 mL。置于培养箱内进行培养4 h，待细胞贴壁后再加入药物浓度为0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/mL斑蝥酸钠维生素B6，培养24、48、72 h，用试验用倒置显微镜观察MG-63细胞形态变化。

1.2.4反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测存活素基因表达 分别提取实验组及对照组细胞的总RNA，进行反转录与扩增。将逆转录的PCR产物应用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳后，运用凝胶成像系统以及分析软件进行数据分析，将存活素吸光度值与β-actin吸光度值的比值来代表存活素相对含量。

1.3 统计学方法

所有数据处理均采用SPSS 14.0版本软件完成，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，应用单因素方差分析进行统计学分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法检测药物对MG-63细胞增殖的抑制作用

MTT分析结果表明，经不同药物浓度的斑蝥酸钠维生素B6处理24、48、72 h以后，人骨肉瘤细胞增殖随浓度增加受到明显抑制，抑制率达到（68.56±5.21）%，其作用具有显著的时间和剂量依赖性（表1）。

2.2 倒置显微镜观察结果

对照组细胞呈现贴壁式生长，生长趋势良好，细胞呈现透明状态，外形为梭形，细胞颗粒较少，细胞分界相对清楚，隐约可见核仁；处理组细胞伴随药物浓度升高和药物作用时间增加，细胞外形逐渐改变为圆形，贴壁式生长细胞显著减少，漂浮生长细胞数明显增加，细胞内结构受到破坏，能够存活的细胞数显著下降，在药物浓度达到5.0 μg/mL时，可以见到大部分细胞出现细胞裂解及大量细胞碎片。

2.3 存活素信使核糖核酸表达

RT-PCR显示：经不同药物浓度斑蝥酸钠维生素B6处理24 h后，存活素信使核糖核酸（survivin mRNA）条带随药物浓度增加蛋白电泳条带的宽度逐渐变窄，条带亮度呈逐渐下降趋势，survivin mRNA/β-actin比值分别为（0.803±0.018）、（0.898±0.015）、（0.933±0.008），与对照组（0.989±0.006）比较，差异有统计学意义（P < 0.05），提示药物浓度逐渐增加，存活素信使核糖核酸（survivin mRNA）表达逐渐降低（图1）。

3 讨论

在临床医学上对于骨肉瘤患者的病情诊断需要借助临床、影像学和病理三结合的诊断原则，20世纪80年代以前医学上采取单纯的手术作为治疗手段，主要包括截肢与保肢，如今伴随着技术的不断发展辅助化疗逐步得到认可，术前化疗-手术-术后化疗的模式已在各国广泛运用，显著改善患者的病情，经过该种模式的综合治疗，患者5年生存率高达60%～80%。但是化疗药物的毒副作用使得应用受到限制，患者身体难以承受，因此寻找一种高效低毒的抗癌药物已经成为国内外共同的研究目标。近年来，由于新辅助化疗存在较大的药物毒副作用，从而导致化疗终止或化疗药物减小剂量，不能达到预期化疗效果，从而显著影响新辅助化疗的疗效发挥[5-6]。由于中药及提取物具有毒副作用低、不容易出现耐药性等特点成为近期研究的焦点[7]。

现在医学上不断在天然草本中寻求合适的中药来提取有效的抗肿瘤成分，不仅拥有毒副作用低的优点，同时能在抗肿瘤病情发展的各个阶段发挥作用，具有多靶点、多环节、多效应的特点。伴随着抗肿瘤药物的研发与应用，科研工作者发现从斑蝥中提取的有效成分斑蝥素，对于多种恶性肿瘤均有治疗作用。斑蝥在我国中医药文化中应用较广，早在公元前12世纪先人就学会用它来进行治疗，药用斑蝥主要为黄黑小斑蝥和南方大斑蝥的干燥全虫，在《本草纲目》、《神农本草经》等作品中都有记载。最新研究证实斑蝥素和它的衍生物对胃癌、小细胞肺癌、附件恶性肿瘤、肝癌以及结肠癌等具有良好的抑制肿瘤细胞生长的作用，并在临床治疗过程中获得良好的治疗效果[8-10]。研究证实斑蝥素可改变人体内多种蛋白质的表达及活性，阻断肿瘤细胞的进一步转移和扩散，同时引发细胞周期阻滞，促使肿瘤的逐步凋亡。最初人们发现的斑蝥素虽然能明显改善肿瘤情况，但它毒性大，容易对患者产生较大的刺激与伤害，因此医学上通过合成斑蝥素衍生物来降低危害，斑蝥酸钠抗肿瘤细胞的活性比斑蝥素显著增强，抗癌谱更广泛，但是斑蝥酸钠的毒副作用较斑蝥素明显减小[11]。斑蝥酸钠是斑蝥素经过氢氧化钠水解生成的半合成衍生物，借助自身的小分子量的优势容易进去患者体内细胞，加强了抗肿瘤效果。制剂中的维生素B6可减少治疗中的恶心、呕吐症状，减轻对泌尿系统的刺激，同时具有升高全血白细胞的作用[12]。

机体细胞凋亡过程进行严格调控，来维持自身生命过程中组织器官的稳定性，但是在细胞凋亡失去控制时，就会引发自身细胞的过度增殖或者过度凋亡[13-14]。正常状态下，人体内的细胞在增殖与凋亡上处于动态平衡，但肿瘤细胞的出现便会打破这一局面，肿瘤细胞在人体内异常增殖导致病情的急剧恶化，因此在治疗过程中控制肿瘤细胞的增殖便是治疗的关键。MTT比色法是一种用来检测细胞增殖活性的有效检测方法，在科研实验中广泛应用[15]，主要通过测定一定波长的吸光度值来快速检测，能比较科学、精确地反映细胞的分裂及增殖。本研究将配比的不同浓度的斑蝥酸钠维生素B6处理24、48、72 h以后，应用MTT比色法测定不同浓度药物对人骨肉瘤细胞增殖的抑制作用，结果显示，药物对MG-63细胞增殖的抑制作用具有时间和剂量依赖性。药物对MG-63细胞的抑制比率可高达（68.56±5.21）%。

凋亡抑制基因存活素是凋亡抑制蛋白家族的新成员之一，1997年由Ambrosini等发现[16]。存活素具有肿瘤表达的特异性，存活素仅在肿瘤和胚胎组织中表达，研究证实其与肿瘤细胞分化增殖和浸润转移有密切相关性，目前成为抗肿瘤基础研究的热点，各国学者对存活素在多种肿瘤中的表达进行了广泛的研究[17-19]。由于存活素有在恶性肿瘤细胞中高表达的特点，科研人员对存活素在骨肉瘤细胞中的表达做了相关研究，认为通过对骨肉瘤组织中存活素的测定，能帮助判断骨肉瘤患者的预后，从而成为骨肉瘤在基因治疗方面的新靶点[20-22]。由于存活素具有仅在肿瘤组织中表达，而正常人体组织中不表达的特性，存活素成为检测骨肉瘤发生、发展的理想肿瘤标志物，并为骨肉瘤患者将存活素为靶点进行精准提供理论基础[23-25]。本研究发现斑蝥酸钠维生素B6可以下调骨肉瘤细胞株中存活素的表达。斑蝥酸钠维生素B6可以下调骨肉瘤细胞株中存活素的表达是该药物可以诱导人骨肉瘤细胞凋亡的理论基础之一，提示斑蝥酸钠维生素B6的抗肿瘤作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡的方式来实现的。

综上所述，斑蝥酸钠维生素B6可以显著抑制MG-63的细胞增殖，并且呈现正相关性，为以后同其他化疗药物的联合应用提供了理论基础。斑蝥酸钠维生素B6在下调人成骨肉瘤细胞存活素基因的表达中发挥作用；斑蝥酸钠维生素B6作为一种中药有效成分的半合成衍生物，可显著抑制MG-63的细胞增殖，体现其在骨肉瘤治疗方面具有广阔的应用前景。

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（收稿日期：2017-02-07 本文编辑：张瑜杰）