“桂枝与白芍”药对化学成分UPLC—Q/TOF—MS分析

陈永财++钱江辉++王彬辉++沙先谊

[摘要] 目的 采用液質联用技术（UPLC-Q/TOF-MS）对“桂枝与白芍”药对中的化学成分进行定性分析。方法 采用Agilent 1290 UPLC和YMC-Triart C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）色谱柱进行快速物质分离；流动相为乙腈-0.1%冰醋酸梯度洗脱；温度：30℃；进样量：5 μL；检测波长：254 nm；流速：0.3 mL/min；AB 5600质谱使用ESI离子源分别在正离子与负离子模式下采集数据。 结果 结合对照品确认了8个化合物，通过质谱信息与相关文献数据推测13个化学成分，对其进行成分归属。其中主要含有没食子酸、原儿茶酸等6种有机酸，芍药苷、芍药内酯苷等10种芍药总苷单萜类化合物及香豆素类成分。 结论 采用UPLC-Q/TOF-MS确定“桂枝与白芍”药对中的化学成分，为阐明“桂枝与白芍”药对的药效物质基础提供有力的证据。

[关键词] 桂枝；白芍；药对；UPLC-Q/TOF-MS；成分鉴定；物质基础

[中图分类号] R927 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）06（a）-0012-05

Chemical constituents analysis of the drug pair of "Cinnamomum cassia Presl and Paeoniae Radix Alba" by UPLC-Q/TOF-MS

CHEN Yongcai1 QIAN Jianghui2，3 WANG Binhui4 SHA Xianyi2，3

1.Department of Pharmaceutics， Hospital of TCM in Wenzhou City， Zhejiang Province， Wenzhou 325000， China； 2.Department of Pharmaceutics， School of Pharmacy， Fudan University， Shanghai 201203， China； 3.Institute of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Fudan University， Shanghai 201203， China； 4.Department of Pharmaceutics， Affiliated Municipal Hospital of Taizhou Medical College， Zhejiang Province， Taizhou 318002， China

[Abstract] Objective To develop an ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of-flight mass spectrometric （UPLC-Q/TOF-MS） method to analyze the chemical constituents in the drug pair of "Cinnamomum cassia Presl and Paeoniae Radix Alba". Methods Agilent 1290 UPLC machine and YMC-Triart C18 column （100 mm × 2.1 mm， 1.9 μm） were adopted to separate ingredients； the mobile phase was acetonitrile （A）-0.1% acetic acid solution （B） with gradient elution； the column temperature was 30℃； the inject volume was 5 μL； the detection wavelength was set at 254 nm； the flow rate was 0.3 mL/min； the mass spectrometer AB 5600 with an electrospray ionization （ESI） interface was under positive or negative mode for data collection. Results 8 compounds were identified by reference substance， 13 compounds were qualitative identified according to the MS/MS information， and the belonging of the main constituents had been confirmed. These compounds included six kinds of organic acid such as gallic acid and protocatechuic acid， tentotal paeoniflorin monoterpenes like paeoniflorin and albiflorin， and coumarins. Conclusion Determination of chemical composition of "Cinnamomum cassia Presl and Paeoniae Radix Alba" by UPLC-Q/TOF-MS in order to clarify the "Cinnamomum cassia Presl and Paeoniae Radix Alba" drug on the basis of the material to provide strong evidence.

[Key words] Cinnamomum cassia Presl； Paeoniae Radix Alba； Drug pair； UPLC-Q/TOF-MS； Compounds identification； Material basis

“桂枝与白芍”为典型的相制配伍，源于《伤寒论》之桂枝汤，为临床常用的调和营卫、温通止痛药对[1-2]。现代研究证明，桂枝中桂皮醛、肉桂酸等成分，白芍中芍药苷、芍药内酯苷等成分具有明显药理活性[3-4]，药对功效物质基础不是二味药叠加，而是二味药不同成分相互作用形成的共同体[5]，可见全面分析核心“桂枝与白芍”药对化学成分尤为关键。

本文采用液质联用技术（LC-Q/TOF-MS），对“桂枝与白芍”药对中的主要化学成分进行鉴定，为进一步阐明“桂枝与白芍”药对的药效物质基础提供有力证据。

1 仪器与试剂

Agilent 1290超高液相色谱仪（安捷伦，美国）、AB 5600+Q-TOF高分辨质谱仪（Applied Biosystems 美国）、Analyst？誖TF1.6采集数据、Peak View 2.0数据分析、色谱柱YMC-Triart C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）、分析天平（BT 25S，北京赛多利斯）、天平（BT 210S，北京赛多利斯）。

乙腈（色谱纯AS1122-801 Tedia）、甲醇（色谱纯MS1922-801 Tedia），其余试剂分析纯。芍药苷、桂皮醛对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110736-201438、110710-201418），儿茶素、没食子酸、原儿茶酸、没食子酸甲酯、芍药苷内酯、没食子酸乙酯、丁香醛、香豆素、肉桂酸、丹皮酚对照品（上海同田制药，批号：15082731、15033122、15090235、15051322、15010332、15072821、15012321、15072141、15051935、15072836）。 桂枝、白芍中药饮片（浙江华宇中药饮片有限公司，批号：1503190、1505100），经浙江中医药大学张水利教授鉴定桂枝为樟科植物肉桂（Cinnamomum cassia Presl）的干燥嫩枝，白芍为毛茛科植物芍药（Paeonia lactiflora Pall）的干燥根。

2 方法与结果

2.1 分析条件

色谱条件：Agilent 1290 UPLC，YMC-Triart C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），流动相乙腈-0.1%冰醋酸水梯度洗脱见表1[6-7]；温度：30℃；检测波长：254 nm；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL。

质谱条件：电喷雾（ESI）源，正负离子模式；雾化气（Gas1）：50 psi；辅助加热气（Gas2）：50 psi；气帘气（Curtain Gas）：30 psi；离子源温度：550℃；正负电压：5500V/-4500V；去簇电压（DP）：±80V；碰撞电压（CE）：±40V；一级MS扫描范围：50～1000；二级MS/MS扫描范围：50～1000。

2.2 混合对照品溶液制备

分别精密称芍药苷、桂皮醛、儿茶素、没食子酸、原儿茶酸、没食子酸甲酯、芍药苷内酯、没食子酸乙酯、丁香醛、香豆素、肉桂酸、丹皮酚12种对照品10 mg，用甲醇配成1 mg/mL母液。取上述各对照品母液200 μL，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，配制成混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

2.3.1 “桂枝与白芍”药对水煎液提取物制备

按“桂枝与白芍”藥对（1∶1）取桂枝90 g、白芍90 g，按正交优选条件[8]加水量10倍、浸泡60 min、煮沸后微火煎煮60 min，合并2次提取液，过滤，减压浓缩并调整浓度至（1∶6）浸膏备用，精密称100 mg浸膏，加50%乙腈水溶液10 mL，涡旋1 min，超声5 min，0.45 μm微孔滤膜过滤，按“2.1”项下色谱条件测定。

2.3.2 桂枝和白芍单味水煎液提取物制备

称桂枝90 g和白芍90 g分别单独煎煮，按“2.3.1”项下方法制备单味桂枝和单味白芍供试品。

2.4 UPLC-Q-TOF-MS化学成分鉴定

“桂枝与白芍”药对（1∶1）水煎液中成分进行快速分离鉴定，得到质谱总离子流图（TIC）如图1。有机酸类和芍药苷类物质在ESI-MS负离子条件下响应更高，质谱结构分析以ESI-解析为主。

2.4.1 对照品化学成分鉴定

通过对照品出峰时间、一级质谱分子量和二级质谱MS/MS碎片峰离子分析鉴定，从12个对照品中鉴定出“桂枝与白芍”药对（1∶1）水煎液有8个化合物（表2），桂枝和白芍单味水煎液分别按同样质谱条件分析，其中没食子酸、原儿茶酸为两味中药共有成分。

2.4.2 化学成分鉴定

采用质谱分析软件Peak View的Fomular Finder和Master View两种功能对主要出峰化合物进行鉴别，通过化合物质谱裂解特征、一二级质谱图、同位素丰度等比对分析，并参考文献和数据库资料后推测[9]。

2.4.2.1 ESI-模式成分鉴定 “桂枝与白芍”药对（1∶1）水煎液ESI-成分鉴定具体见表3。

tR为2.920 min在ESI-下准分子离子峰m/z为495.1508[M-H]-，特征离子峰m/z 137为对羟基苯甲酸，m/z 165为蒎烷基本骨架；分子离子脱去糖苷为m/z 333[M-C6H10O5-H]-；分子离子脱去甲醛为m/z 465[M-CH2O-H]-等离子峰与文献报道一致。因此推断该化合物为氧化芍药苷[10]。

tR为3.568 min在ESI-下准分子离子峰m/z为525.1603[M-H]-，脱去一分子甲醛为m/z 495[M-CH2O-H]-，再脱去水为m/z 479[M-CH2O-H2O-H]-；其中特征离子峰m/z 167为C8H7O4；分子离子脱去糖苷为m/z 345[M-C6H12O6-H]-；m/z 363[M-C6H12O6-H]-等离子峰与文献报道一致，因此推断该化合物为牡丹皮苷E[11]。

tR为3.872 min在ESI-下准分子离子峰m/z为687.2131[M+COOH]-，特征离子峰为苯甲酰m/z 121，脱去苯甲酰基为m/z 519[M-C7H5O2-H]-，再脱去CO2为m/z 475[M-C7H5O2-CO2-H]-；分子脱去糖苷和苯甲酰基为m/z 195[M-2Glu-C7H5O2-H]-，因此推断该化合物为6'-O-β-glucopyranosyl-albiflorin[12]。

tR为5.174 min在ESI-下准分子离子峰m/z为687.2131[M+COOH]-，特征离子峰为苯甲酰m/z 121，脱去苯甲酰基为m/z 519[M-C7H5O2-H]-，再脱去甲醛为m/z 489[M-C7H5O2-CH2O-H]-；脱去甲醛为m/z 611[M-CH2O-H]-；脱去糖苷和苯甲酰基为m/z 195[M-2Glu-C7H5O2-H]-，因此推断该化合物为β-gentiobiosylpaeoniflorin[13]。

tR为7.295 min和10.588 min在ESI-下准分子离子峰m/z为525.1602[M+COOH]-，其中7.295 min通过对照品确认为芍药苷。特征离子峰为苯甲酰m/z 121，蒎烷基本骨架m/z 165，苯环基本骨架m/z 77；脱去甲醛为m/z 449[M-CH2O-H]-，再脱去水为m/z 431[M-CH2O-H2O-H]-；脱去一份子苯甲酰基为m/z 357[M-C7H5O2-H]-；脱去糖苷为m/z 327[M-C6H12O5-H]-[10]。而14.810 min断裂方式与芍药苷相同，因此推断为芍药苷同分异构体。

tR为12.167 min在ESI-下准分子离子峰m/z为631.1689[M-H]-，特征离子峰为没食子酰m/z 169，没食子酰脱去一个CO2特征峰m/z 125和没食子酰与糖苷结合物碎片峰m/z 313；脱去苯甲酰基为m/z 509[M-C7H5O2-H]-，再脱去水为m/z 491[M-C7H5O2-H2O-H]-。根据元素组成分子式为C30H32O15，因此推断该化合物为没食子酰芍药苷[10]。

tR为14.810 min在ESI-下准分子离子峰m/z为525.1621[M+COOH]-，特征离子峰m/z 283为[M-CO2-C7H5O2-H]-，其中CO2为内酯环断裂失去酯基与芍药苷内酯相同，根据文献报道推断该化合物为同分异构体芍药内酯苷R1[14]。

tR为17.782 min在ESI-下准分子离子峰m/z为263.1362[M-H]-，特征离子峰为m/z 119和m/z 136；脱去CO2为m/z 219[M-CO2-H]-，再脱去甲基为m/z 204[M-CO2-CH3-H]-，再脱去甲基为m/z 189[M-CO2-2CH3-H]-。根据元素组成分子式为C15H20O4，因此推断该化合物为sydowic acid。

tR为22.896 min在ESI-下准分子离子峰m/z为629.1865[M+COOH]-，特征离子峰为苯甲酰m/z 121，苯环特征峰m/z 77和蒎烷骨架峰m/z 165；分子脱去氢为m/z 583[M-H]-，再脱去甲醛为m/z 553[M-CH2O-H]-，再脱去水为m/z 535[M-CH2O-H2O-H]-[10]。根据元素组成分子式为C30H32O12，因此推断该化合物为苯甲酰芍药苷。

tR为28.098 min在ESI-下准分子离子峰m/z为296.1049[M-H]-，苯环特征峰m/z 77；分子脱去水为m/z 277[M-H2O-H]-，再脱去CO2为m/z 233[M-CO2-H2O-H]-。根据元素组成分子式为C18H16O4，因此推断该化合物为吐昔酸。

2.4.2.2 ESI+模式成分鉴定 “桂枝与白芍”药对（1∶1）水煎液ESI+成分鉴定具体见表4。

tR为14.469 min在ESI+下准分子离子峰m/z为147.0441[M+H]+，特征离子峰为苯环m/z 77；分子脱去CO2为m/z 103[M-CO2+H]+，炔基断裂失去碳原子为m/z 91。根据元素组成分子式为C9H6O2，因此推断该化合物为苯基丙酸。

tR为17.747 min在ESI+下准分子离子峰m/z为161.0698[M+H]+，特征离子峰为苯环m/z 77；分子脱去一个甲基为m/z 146[M-CH3+H]+，再脱去一氧化碳为m/z 118[M-CH3-CO+H]+[15]。根据元素组成分子式为C10H8O2，因此推断该化合物为甲基香豆素。提取22.211 min分子离子峰m/z为161[M+H]+，MS/MS结构相似，推测为甲基香豆素同分异构体。根据出峰时间推断17.747 min为6-甲基香豆素，22.211 min为7-甲基香豆素。

3 讨论

本实验采用伤寒论中“桂枝汤”煎煮方法[2]，按正交试验优选条件提取水煎液中仅含极少量桂皮醛[8]等挥发油，可减压浓缩过程中挥发油被耗散殆尽，因此“桂枝与白芍”药对供试样品中未发现桂皮醛色谱峰。

本实验建立“桂枝与白芍”药对水煎液UPLC-Q-TOF/MS快速分析的方法，基于化合物谱裂解特征、相关数据库和参考文献，鉴定了“桂枝与白芍”药对水煎液中21个化合物，其中主要含有没食子酸、肉桂酸等6种有机酸和芍药苷、芍药内酯苷及其同分异构体等10种芍药总苷单萜类化合物及香豆素类成分。现代研究证明，没食子酸、肉桂酸、芍药总苷、香豆素等成分具有明显药理活性[16-20]，可见“桂枝与白芍”药对水煎液中有机酸、芍药总苷单萜类、香豆素类等化学成分为“桂枝与白芍”药对的药效物質基础提供科学依据。

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（收稿日期：2017-02-11 本文編辑：李亚聪）