去氧穿心莲内酯的大鼠肠吸收特征研究

伍治中++叶玲

[摘要] 目的 检测并分析去氧穿心莲内酯的油水分配系数和大鼠肠道吸收特性。 方法 采用摇瓶法和大鼠在体肠灌流模型，运用UPLC法测定去氧穿心莲内酯的油水分配系数、化学生物稳定性及其在肠灌流液和胆汁中的含量。 结果 去氧穿心莲内酯在pH=6.5的缓冲液的油水分配系数Log P=1.45±0.12，其化学和生物稳定性均良好；在十二指肠、空肠、回肠和结肠的吸收率分别为30.29%、28.39%、22.04%和34.63%；去氧穿心蓮内酯胆汁排泄量为灌流药物总量的0.146%。 结论 去氧穿心莲内酯在大鼠的各肠段均有吸收，不同肠段吸收率无显著性差异。

[关键词] 去氧穿心莲内酯；大鼠肠灌流；吸收

[中图分类号] R965 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）06（a）-0008-04

Study on the intestinal absorption characteristics of deoxydeoxyandrographolide in rats

WU Zhizhong1 YE Ling2

1.Department of Pharmacy， Shenzhen Shahe Hospital， Guangdong Province， Shenzhen 518053， China； 2.College of Pharmacy， Southern Medical University， Guangdong Province， Guangzhou 510000， China

[Abstract] Objective To measure and analyze the oil-water partition coefficients and intestinal absorption characteristics of deoxyandrographolide in rats. Methods The shaking method and rat intestinal perfusion model in vivo was used. Oil-water partition coefficient， chemical and biological stability were measured by UPLC， and contents in intestinal perfusate and bile were determined. Results Oil water partition coefficient Log P=1.45±0.12 of deoxyandrographolide in the HBSS （pH 6.5）， and its chemical and biological stability were well. In the perfusion model， the absorption of deoxyandrographolide in duodenum， jejunum， ileum and colon were 30.29%， 28.39%， 22.04% and 34.63%. On the other hand， deoxyandrographolide was excreted by bile with 0.146% of total prefused amount of deoxyandrographolide. Conclusion Deoxyandrographolide in various intestinal segments of rats are absorbed， but there is no significant difference on absorption rate in different intestinal segments.

[Key words] Deoxydeoxyandrographolide； Rat intestinal perfusion； Absorption

去氧穿心莲内酯（DAG）（结构式见图1），又名穿心莲甲素，是从传统中药穿心莲中分离得到的一种二萜内酯类化合物，也是其活性单体之一。现代药理学研究表明，去氧穿心莲内酯是良好的天然化疗增敏剂，同时具有显著的抗免疫、抗疟疾作用、抗菌、抗癌、保肝作用和抗高血压等活性[1-3]。目前，已有报道研究了穿心莲其他活性单体如穿心莲内酯、去水穿心莲内酯等在肠吸收方面的行为[4-5]，但由于去氧穿心莲内酯为脂溶性化合物，水溶性较差，且在穿心莲提取物中含量偏低的特点，使得其在肠吸收特征方面研究较少。药物肠吸收的研究方法有多种，包括在体、离体及细胞模型法，其中观察药物于小肠内吸收水平的实验方法常选用在体大鼠肠灌流，这是现今药物吸收、排泄以及代谢实验的首选方法[6-8]。本研究采用大鼠在体肠灌流模型分析去氧穿心莲内酯的肠道吸收特征，为今后的应用开发提供参考依据。

1 仪器、试剂及实验动物

1.1 仪器

1100/1200系列可变波长检测器（VWD），北京京普科技有限公司；美国Waters BreezeTM 2高效液相色谱仪，香港德祥科技有限公司；Radwag/XA.3Y.A分析天平，广州围谷润仪器有限公司；德国Eppendorf仪器：5427 R小型台式冷冻高速离心机，苏州达麦迪生物有限公司；KDS 53220V多通道注射泵，赞德仪器有限公司；电热恒温水槽SSW-600-2S，广州步步宏科学仪器设备有限公司；Wiggens Vortex 3000涡旋振荡器，北京乾明基因技术有限公司；pH300便携式pH计，广东东南科仪；SZ-96A自动纯水蒸馏器，北京东南仪诚实验室设备有限公司。

1.2 试剂及药品

去氧穿心莲内酯对照品（成都普菲德生物技术有限公司，纯度98%以上）；睾丸酮（货号：C17322500，英文名称：Testosterone 0，CAS号：58-22-0，规格：250 mg，上海江莱生物科技有限公司，纯度98%以上）；HBSS（货号：SH30030.02B；品名和规格：HBSS 1个，上海子起生物科技有限公司）；缓冲盐粉末（货号：GL0035，规格：1 L，北京百奥莱博科技有限公司）；甲醇、乙醇、乙腈、水、葡萄糖、碳酸氢钠和氯化钠等均为分析纯。

1.3 实验动物

Sprague-Dawley（SD）大鼠，雄性，SPF级，动物许可证号：SYXK（京）2016-0113，北京维通利华实验动物技术有限公司。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC？誖BEH C18 1.7 μm，2.1 mm×50 mm Column；检测器：二级管阵列检测器；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸（B），采用梯度洗脱方法：0～0.8 min，10% B，0.8～2.0 min，10%～35% B，2.0～4.0 min，35%～50% B，4.0～4.5 min，50%～60% B，4.5～5.0min，60%～10% B；流动相流速：0.3 mL/min；检测波长：206 nm；进样体积10 μL。该色谱条件下，各物质的灵敏度高，分离度好，适用于去氧穿心莲内酯及内标的检测，测试结果见图2。

2.2 化学稳定性考察

2.2.1 方法 HBSS缓冲液的pH值调至1.0、5.0、7.4以及8.0，将去氧穿心莲内酯溶解至40 μmol/L，进行37℃水浴，于0、1、2、4、6、8 h加入内标，静止后以13 000 r/min离心30 min，进样采用UPLC实验方法。观察去氧穿心莲内酯的HBSS缓冲液在pH值1.0～8.0之间、8 h内是否稳定。每个样品平行进行3次检测。

2.2.2 结果 37℃条件下，处于不同pH条件下的去氧穿心莲内酯浓度变化见图3，其中，去氧穿心莲内酯在强酸条件（pH=1）下含量有所减少，稳定性较差；而在pH=5.0～8.0条件下稳定性良好。

2.3 油水分配系数的测定

2.3.1 方法 配制pH为6.5的HBSS缓冲液作为水相，油相为正辛醇，使油相以及水相等体积混合，并放置于10 mL EP管内，在水浴摇床器上振摇24 h后取出，分为上下两层，其中正辛醇饱和的水层为下层，水饱和的正辛醇层为上层[9]。

準确称取去氧穿心莲内酯，分别用上述下层溶液溶解，得到未饱和的不同浓度的供试品溶液。各供试品液取少量，用50%甲醇稀释至线性范围后，取少量加入内标后分别进样UPLC，测定初始浓度P0。分别移取供试液各1 mL，置入上层水饱和的正辛醇层溶液各1 mL，涡旋5 min后放置于恒温振荡器内，37℃环境下震荡48 h以充分平衡，涡旋离心100 r/min。充分平衡后，分离出水层，用50%甲醇稀释到线性范围后，加内标按UPLC法进样10 μL分析，记录峰面积，计算相应浓度Pw。按以下公式算出去氧穿心莲内酯的表观油/水分配分配系数： ，并计算其数值Log P。其中，P0为去氧穿心莲内酯在正辛醇饱和的水中的初始浓度，Pw为分配平衡时在水相中测得的去氧穿心莲内酯浓度。

2.3.2 结果 去氧穿心莲内酯在pH=6.5的缓冲液中的油水分配系数为Log P=1.45±0.12。

2.4 大鼠在体肠灌流实验

2.4.1 手术 开始前对进行实验的所有大鼠禁食12 h，自由饮水。称重后予以50%乌拉坦2.8 mL/kg腹腔注射，麻醉后，固定，剃毛，置于灯光下，维持常规体温。沿腹中线打开腹腔（约4.0 cm），靠近十二指肠处插入胆汁导管，分别在十二指肠、空肠、回肠、结肠的两端插聚乙烯管，并用灭菌的手术线固定。实验时用等渗生理盐水浸渍的纱布覆盖于肠组织表面以保湿，用等渗生理盐水冲洗肠内容物后换灌流液平衡30 min。实验结束以50%乌拉坦过量注射处死试验大鼠，剪取灌流肠段，测量并记录各肠段长度[10]。

2.4.2 生物稳定性考察 分别用空白HBSS缓冲液对大鼠4个肠段灌流3 h，流速为10 mL/h，然后采用此空白灌流液配制去氧穿心莲内酯40 μmol/L，放于37℃水浴内，于0、1、2、4、6、8 h分别取样，150 μL样品加入200 μL含20 μmol/L睾酮的甲醇溶液，涡旋混匀，13 000 r/min离心30 min，取上清液，利用UPLC检测去氧穿心莲内酯在不同时间点内各个肠段中空白灌流液含量。结果显示，在各肠道中，肠道酶对去氧穿心莲内酯的水解作用较弱，8 h内几乎无水解作用。见图4。

2.4.3 在体肠灌流 分别在4个肠段回流，监测去氧穿心莲内酯大鼠各个肠段的吸收率。精确称重所有样品管，得出样品净重和记录。吸取4个时间段各肠段灌流液150 μL至1.5 mL离心管内，并置入150 μL含20 μmol/L睾酮的甲醇溶液，进行涡旋混匀，13 000 r/min离心30 min，取上层清液实施UPLC检测，其余灌流样品于-70℃液氮内进行保存备检。

按以下方程式计算渗透系数： ；

其中，为测量因素校正因子，对流速、肠长度等因素进行修正；和分别为经校正的进出口灌流液中药物浓度。

按下列方程式计算肠段吸收率：Mab=Qτ（CAin-CAout），式中Mab是去氧穿心莲内酯的吸收量，M原为灌流前溶液，灌流的速度用Q表示，τ单一样品收集的时间段为30 min，进口溶液的浓度（μmol/L）采用CAin表示，出口溶液的浓度（μmol/L）用CAout表示。吸收率（%）=Mab/M原。结果显示，去氧穿心莲内酯在十二指肠、空肠、回肠和结肠的吸收率分别为30.29%、28.39%、22.04%和34.63%，差异不大。见图5。

2.4.4 胆汁排泄情况 精确称重所有样品管，得出样品净重并做记录。分别取4个时间段胆汁50 μL，加入100 μL HBSS液稀释，再加入10 μL含200 μmol/L睾酮的甲醇溶液，13000 r/min离心30 min，取上清液进行UPLC检测。胆汁样品内氧穿心莲内酯含量检测结果显示，胆汁内去氧穿心莲内酯水平呈持续升高趋势，于90 min这一时间点保持平衡，计算结果表明，胆汁内去氧穿心莲内酯总量占灌流总量的0.146%。见图6。

3 讨论

体肠灌流是临床首选用于阐明药物在体吸收机制以及药物动力学的简便易行的研究手段[11-13]。已证实，利用大鼠在体肠灌流模型来预测并评价药物在人体内的吸收相关性好，相关系数（R2）高达0.97，其实验结果可推。实验优势在于不仅能够在在体大鼠肠灌流实验中保持大鼠良好的生理状态，还可以维护肠道内的代谢酶活性，广泛应用于研究药物吸收[14-15]。因此，本研究采用大鼠肠灌流模型以进行去氧穿心莲内酯的肠道吸收行为与特征的研究。

结果显示，在各肠道中肠道酶对去氧穿心莲内酯的水解作用较弱，8 h内几乎无水解作用；去氧穿心莲内酯在各肠段均有吸收，但总吸收量均不高；在肠灌流模型胆汁中能检测到去氧穿心莲内酯，说明去氧穿心莲内酯经胆汁排泄，但排泄量不大。笔者前期研究综合了Caco-2细胞模型、MDR1-MDCKⅡ细胞模型以及大鼠在体肠灌流模型以研究穿心莲内酯的吸收特征，结果证实，穿心莲内酯于十二指肠以及空肠的吸收率较回肠及结肠显著，其生物利用度低与磺酸化代谢和P-糖蛋白的作用密切相关[16]。脱水穿心莲内酯为14-去氧-11，12脱氢穿心莲内酯，其在肠道中的吸收较好，不发生代谢转化，外排转运蛋白也不参与其细胞的转运[17-19]。

口服给药途径的优势为临床给药方便，是最常用的给药方式[20]。因此，为缓解给药剂型设计的盲目性以及提供剂型开发的科学依据，实验对药物于胃肠道的吸收转运情况进行研究。本研究结果表明，即使去氧穿心莲内酯在大鼠的各肠段吸收水平不同，但其在整个肠道均有吸收，提示去氧穿心莲内酯的口服应用是可行的。

[参考文献]

[1] 吕巧，涂国刚，王嘉琦，等.穿心莲内酯的研究进展及临床应用[J].南昌大学学报，2013，53（1）：83-86.

[2] Rollinger JM，Schyschka L. Neoandrographolide from Andrographis paniculata as a Potential Natural Chemosensitizer [J]. Planta Medica，2015，76（15）：1698-1700.

[3] Fau-Takano F. Suppression of NO production in activated macrophages in vitro and ex vivo by neoandrographolide isolated from Andrographis paniculata [J]. Biol Pharm Bull，2014，25（16）：1169-1174.

[4] 华素，李园园，赵军利.穿心莲提取物中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯大鼠肠吸收特性研究[J].中草药，2014，45（21）：25-29.

[5] 廖琼峰，姚媛，谢智勇.穿心莲内酯在Caco-2细胞单层模型中的吸收机制[J].中草药，2011，42（7）：1363-1366.

[6] 颜隆，朱建平.中药剂型理论的现代药物动力学诠释[J].世界中西医结合杂志，2015，10（2）：262-267.

[7] 莫李立，王素军.口服药物吸收模型的研究进展[J].广东药学院学报，2011，27（1）：123-134.

[8] 张字城，李新，李琳琳.动物肠吸收模型在药物研发中的应用[J].医学综述，2015，21（5）：775-778.

[9] Tak？觃cs-Novak K，Avdeef A. Interlaboratory study of log P determination by shake-flask and potentiometric methods [J]. J Pharm Biomed Anal，1996，14（11）：1405-1413.

[10] Kataoka，Itsubata，Masaoka，et al. In vitro discussion/permeation system to predict the oral absorption of poorly water-soluble drugs：effect of food and dose strength on it [J]. Bio Pharm Bull，2011，34（3）：401-407.

[11] 王明娟，何风艳，郑笑为.消炎利胆片中穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯及其总量测定能力验证项目的结果分析[J].中国药事，2014，28（9）：981.

[12] Ye L，Liang FG. Oral bioavailability and intestinal disposition of dehydroandrographolide in rats [J]. J South Med Univ，012，32（8）：1074-1080.

[13] 李兴平，李东晓，邓文龙.脱水穿心莲内酯、穿心莲内酯的鼠胃肠吸收研[J].中药药理与临床，2011，27（1）：14-15.

[14] Wang Y，Chen YH，Xu H，et al. Analgesic effects of glycoproteins from Panax ginseng root in mice [J]. J Ethnopharmacol，2013，148（3）：946-960.

[15] Escribano E，Sala XG，Salamanca J，et al. Single-pass intestinal perfusion to establish the intestinal permeability of model drugs in mouse [J]. Int J Pharm，2012，436（2）：472-477.

[16] Ye L，Wang T，Tang L，et al. Poor oral bioavailability of a promising anticancer agent andrographolide is due to extensive metabolism and efflux by P-glycoprotein [J]. Pharm Sci，2011，100（11）：5007-5017.

[17] 叶玲，梁福贵，杨晓珊，等.脱水穿心莲内酯在大鼠体内的口服生物利用度和肠道处置[J].南方医科大学学报，2012，32（8）：1074-1081.

[18] 张红星.穿心莲叶含量对药材质量影响的研究[J].中国现代药物应用，2015，9（5）：265-266.

[19] Tremblay YD，Lamarche D，Chever P，et al. Characterization of the ability of coagulase- negative staphylococci isolated from the milk of Canadian farms to form biofilms [J]. J Dairy Sci，2013，96（1）：234-236.

[20] Ma Y，Sun S，Peng CK. Applications of dynamical complexity theory in traditional Chinese medicine [J]. Front Med，2014，8（3）：279-284.

（收稿日期：2017-02-11 本文編辑：程 铭）