基于抗性恢复的高效克隆超短片段重组质粒的构建

刘美丽，罗砚曦，赵铮蓉，阎辉



基于抗性恢复的高效克隆超短片段重组质粒的构建

刘美丽，罗砚曦，赵铮蓉，阎辉

浙江省医学科学院药物研究所 浙江 杭州 310013

刘美丽, 罗砚曦, 赵铮蓉, 等. 基于抗性恢复的高效克隆超短片段重组质粒的构建. 生物工程学报, 2017, 33(7): 1190–1197.Liu ML, Luo YX, Zhao ZR, et al. Cloning short gene fragment and constructing recombinant plasmid based on restoration of antibiotic resistance. Chin J Biotech, 2017, 33(7): 1190–1197.

分子克隆作为一种常规技术被广泛应用于DNA及蛋白质的研究。在传统的分子克隆中，主要通过限制性内切酶先分别消化目的DNA片段及载体，再纯化回收，然后用DNA连接酶将二者连接。而对一些超短基因片段 (<300 bp)，通过酶切及切胶纯化后，回收率极低，导致插入表达载体比较困难。文中介绍了一种新的利用质粒抗性恢复进行克隆的方法，大大提高了克隆效率，为短基因片段的分子克隆提供了一种高效的方法。

分子克隆，构建，短基因片段

分子克隆技术是分子生物学和基因工程研究中的一种常用技术[1]。随着基因工程的发展，出现了一些新技术的应用，如GATEWAY系统[2-4]、In-fusion系统[5-7]、尿嘧啶DNA糖基化酶 (Uracil-DNA glycosylase，UDG)[8-10]以及连接非依赖克隆 (Ligation-independent cloning，LIC)[11-13]等。但这些新技术要么所需酶类价格昂贵 (如GATEWAY系统，In-fusion系统)，要么应用条件苛刻 (如LIC，需要在重叠区段缺少某个特定核苷酸[11,14])，无法广泛应用，因而传统的酶切、连接方法仍然是分子克隆中使用最广泛的方法。

尽管传统的分子克隆技术改进了很多，有的已转化为商品化的克隆试剂盒，如T载体克隆[15-16]、重组融合PCR[17-19]和TOPO克隆技术[20]等，但对于将超长或超短 (<300 bp) 目的基因片段插入表达载体仍然比较困难，尤其是后者。造成超短片段难以克隆的主要原因是，超短DNA片段经过必需的末端酶切处理和切胶纯化后，通常损失殆尽，难以回收足够量的末端修饰的DNA片段与载体连接。并且，由于插入片段很短，故重组体与空载体“背景”分子量几乎相同，导致重组体的鉴别很困难。

本研究在构建人β-防御素-2 (human β-defensin 2，HBD2) 表达载体的过程中，探索出一种基于抗性恢复的表达质粒构建方法，比较圆满地解决了上述难题。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 载体和宿主菌

真核载体pCB，宿主菌DH5α由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂

DNA marker购自北京全式金生物技术有限公司。T4 DNA连接酶购自宝生物工程 (大连) 有限公司。实验中所使用的限制性内切酶购自NEB公司。DNA纯化回收试剂盒、PCR试剂盒、质粒提取试剂盒及琼脂糖均购自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 人β-防御素-2 (HBD2) 引物设计与合成

根据人β-防御素-2 (HBD2) 的基因序列(GenBank登录号AF040153.1)，采用Vector NTI软件设计一对PCR引物 (表1)，由上海生工合成。以含人工合成HBD2基因片段的质粒pMD-HBD2 (另文报告) 为模板，用上述引物及酶进行PCR扩增。扩增条件：94 ℃预变性 5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳后，用DNA纯化回收试剂盒回收约200 bp的HBD2目的片段。

表1 PCR引物序列与预期产物长度

1.2.2 重组表达质粒的构建与鉴定

将真核载体pCB用Ⅰ和Ⅰ进行双酶切，37 ℃反应3 h后，取酶切产物电泳，在显像仪下观察，得两条目的条带，其中1.7 kb片段的两端分别包含pCB质粒的氨苄青霉素抗性基因 (Ap-r) 的半侧及多克隆位点，而3.2 kb片段则包含Ap-r抗性基因的另外半侧及质粒骨架 (图6)，然后用DNA纯化回收试剂盒分别回收上述DNA片段。

将HBD2与1.7 kb的纯化产物等摩尔比混合，用T4 DNA连接酶连接。连接条件：25 ℃ 60 min，60 ℃ 10 min。

以上述连接产物为模板，用酶和引物Amp-Sc及HBD2-Bm (表1) 进行PCR扩增，得到约1.9 kb的片段。扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 4 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳后，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段。

用Ⅰ酶将回收的1.9 kb片段及之前的3.2 kb片段分别进行酶切，37 ℃反应3 h。酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳后，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段。将二者回收的片段等摩尔比混合，用T4 DNA连接酶连接，连接条件：25 ℃ 60 min，60 ℃ 10 min。

将上述连接产物转化大肠杆菌感受态，接种于含氨苄青霉素 (Amp) 的LB培养板，过夜后挑菌落进行PCR扩增鉴定，选取其中1个阳性菌落提取质粒。

1.2.3 重组质粒测序

构建好的质粒由上海生工生物工程股份有限公司进行序列测定。

1.2.4 PCB-HBD2转染后的表达

重组质粒根据说明书与脂质体混合后转染293细胞，转染4 h后加入野生型痘苗病毒感染2 h，然后加入含2%新生牛血清的细胞培养液，48 h后收集细胞和培养上清，在–80 ℃/37 ℃反复冻融3次，离心取上清，得到重组病毒。载体质粒作为阴性对照进行相同处理。用病毒RNA抽提纯化试剂盒提取病毒RNA，对其进行RT-PCR鉴定。

根据TaKaRa公司PrimeScriptTMRT resgent Kit试剂盒操作说明书合成cDNA，以cDNA为模板，以HBD2-Bm和Spe-HBD2为引物进行PCR扩增。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。

2 结果

2.1 HBD2的PCR扩增

PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳，可看到在200 bp附近有一特异性的DNA条带，与预期目的条带196 bp相符(图1)。

2.2 酶切载体

将真核载体pCB用Ⅰ和Ⅰ进行双酶切，在约1.7 kb和3.2 kb处有特异性条带 (图2)。

图1 HBD2 PCR扩增产物

图2 pCB质粒双酶切凝胶电泳结果

2.3 构建融合片段

将上述纯化后的HBD2 PCR产物与pCB酶切后1.7 kb片段连接，并以连接产物为模板，以HBD2-Bm、Amp-Sc为引物进行PCR扩增，得到约1.9 kb片段 (图3)。

2.4 重组质粒转化鉴定

用Ⅰ将回收的1.9 kb片段及之前的3.2 kb片段分别进行酶切，酶切产物用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌感受态，接种于含Amp的LB培养板，过夜后挑菌落进行PCR扩增鉴定，结果见图4，有6个阳性菌落，选其中1个测序鉴定。

图3 HBD2与1.7kb融合片段

图4 菌液PCR鉴定结果

2.5 重组质粒测序鉴定

重组质粒测序结果经过比对，目的片段与人β-防御素-2 (HBD2,GenBank登录号AF040153.1) 完全一致，表明重组质粒构建 成功。

2.6 RT-PCR结果

重组质粒经转染感染后得到的产物进行RT-PCR鉴定，在200 bp左右出现条带 (图5)，与预期相符。

图5 RT-PCR鉴定结果

3 讨论

本文介绍了一种新的利用质粒抗性恢复进行克隆的方法，实验流程如图6所示。

真核载体PCB具有氨苄青霉素抗性基因 (Ap-r)，而Ap-r片段中包含Ⅰ单酶切位点，因此设计PCR引物Amp-Sc，涵盖Ap-r的Ⅰ识别位点。再用Ⅰ和载体多克隆位点 (MCS) 中的平端酶Ⅰ双酶切载体，产生含载体骨架的3.2 kb大片段和另外一条约1.7 kb的小片段，二者分别带有Ap-r基因的半侧，将这两个载体片段切胶纯化备用。接着将1.7 kb的小片段与酶扩增的HBD2用T4 DNA连接酶连接，然后以此连接产物为模板，用涵盖Ap-r的Ⅰ识别位点的引物Amp-Sc和HBD2的上游引物HBD2-Bm进行PCR，即可成功将短片段HBD2融合进载体小片段。最后，将此融合片段用Ⅰ酶切后，与载体大片段连接，转化感受态大肠杆菌后，筛选Ap-r阳性菌落即可得到所需克隆。

图6 基于质粒抗性恢复的克隆方法图解

由于Ⅰ和Ⅰ均为平端酶，用这两个酶双酶切处理的片段为平末端，所以两个平末端片段连接后，理论上连接方向正确的几率为50%，但在本方法中，不用担心克隆连接方向错误的另外50%可能性，因为连接方向错误的克隆将导致Ap-r抗性基因的完整性缺损，致使连接产物在转化细菌后丧失Ap-r抗性，转化菌在含Amp抗生素的LB平板上不能生长，藉此原理强力淘汰错误克隆。从原理上说，本方法可达成“零背景”克隆的效率，但实验中仍发现少数转化菌不含预期的重组体但在Amp抗生素的LB平板上也能生长 (图4，泳道4和5)，其原因尚不明，但不排除酶切处理质粒载体母体不完全导致Ap-r抗性基因“污染”的可能性。

将超长或超短基因片段插入表达载体是分子克隆技术中的难点，尤其是后者。杨艳等[21]曾利用抗性恢复的策略克隆染色体上大片段DNA (48 kb)，但对于超短片段的克隆却鲜有报道。防御素是一类小分子抗菌多肽，广泛存在于昆虫、植物和动物体内，其中人β-防御素-2 (Human β-defensin 2，HBD2) 是人体中第一个被发现的可诱导性防御素，它具有抗微生物[22-23]、抗肿瘤及免疫调节[24-25]等广泛生物活性，在基因治疗和重组疫苗等领域具有重要用途。

但是由于HBD2是仅有192 bp的短基因片段，用常规的“酶切处理后切胶纯化”的方法，回收的目的片段量非常少，克隆效率极低。因此在本研究中我们采用了上述基于抗性恢复的克隆方法：由于载体的大、小片段各含有氨苄青霉素抗性基因 (Ap-r) 的半侧，只有连接方向正确的质粒，才能恢复Ap-r抗性。

和传统方法相比，“基于抗性恢复”的克隆方法具有以下优点：1) 高效性：短基因片段通过PCR与载体片段的一部分融合，大大提高了插入载体的效率；2) 通用性：任何克隆困难的短基因片段，都可用该方法克隆进任何具有Amp筛选标记的表达载体，为短基因片段的克隆提供了一种有效方法；3) 价格低廉：不需要任何商品化的克隆试剂盒，也不需要价格昂贵的酶，在提高效率的前提下并未增加成本，具有良好的应用前景。

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(本文责编 郝丽芳)

Cloning short gene fragment and constructing recombinant plasmid based on restoration of antibiotic resistance

Meili Liu, Yanxi Luo, Zhengrong Zhao, and Hui Yan

Institute of Materia Medica, Zhejiang Academy of Medical Sciences, Hangzhou 310013, Zhejiang, China

Molecular cloning is one of the most important and widely used technologies in molecular biology research. Generally, the target DNA fragment and the vector are separately digested by restriction enzyme, then purified and recovered, and then ligated with DNA-ligase. For some very short gene fragments (<300 bp), the recovery efficiency of the purified fragment is very low after digestion and cleavage, leading to the difficulty in its inserting into the expression vector. To address this issue, we developed a cloning method based on restoration of antibiotic resistance in constructing recombinant plasmid, which proved highly efficient in cloning very short gene fragments.

molecular cloning,plasmid construction, short gene fragment

January 17, 2017; Accepted:May 10, 2017

Hui Yan. Tel: +86-571-88215439; E-mail: jipei2006@163.com

Supported by:Zhejiang Province medical and health research projects (No. 2014KYA041).

浙江省医药卫生科研项目 (No. 2014KYA041) 资助。