家蚕精氨酸激酶原核表达纯化、结构与活性分析

何华伟，王叶菁，赵敏健，位曙光，赵朋，蒋文超，刘莉娜，赵萍



家蚕精氨酸激酶原核表达纯化、结构与活性分析

何华伟1，王叶菁2，赵敏健2，位曙光1，赵朋1，蒋文超1，刘莉娜1，赵萍1

1 西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室，重庆 400715 2 西南大学生物技术学院，重庆 400715

何华伟, 王叶菁, 赵敏健, 等. 家蚕精氨酸激酶原核表达纯化、结构与活性分析. 生物工程学报, 2017, 33(7): 1109–1123.He HW, Wang YJ, Zhao MJ, et al. Prokaryotic expression, purification and characterization of arginine kinase of Bombyx mori. Chin J Biotech, 2017, 33(7): 1109–1123.

精氨酸激酶(Arginine kinase，AK) 是无脊椎动物体内能量代谢的关键酶，在生长发育、营养利用、免疫抗性、胁迫应答等生命活动过程中发挥着重要的调控作用。家蚕精氨酸激酶BmAK与能量平衡、抗NPV病毒过程相关，但目前关于其分子结构和酶学性质的研究不多。克隆了基因ORF序列，分析了其染色体定位、基因组结构、mRNA结构、二级结构和三级结构。进化分析表明AK在进化过程中高度保守。原核表达获得了可溶性的BmAK重组蛋白，通过Ni-NTA亲和层析纯化了BmAK。圆二色光谱分析显示BmAK包含α螺旋结构，其α螺旋结构在pH 5–10范围内相对稳定。酶活分析表明BmAK的最适温度为30 ℃，最适pH为7.5。25 ℃时BmAK的催化活性最大，在15–30 ℃范围内，BmAK的结构相对稳定，活性差别不大。BmAK的结构在pH 7.0左右相对稳定。这些研究为揭示BmAK的结构和功能提供了基础，有助于开发以AK为分子靶标的绿色安全环保的新型杀虫剂。

家蚕，精氨酸激酶，表达纯化，结构，活性

精氨酸激酶(Arginine kinase, AK) (EC 2.7.3.3) 是无脊椎动物体内一种重要的磷酸原蛋白激酶。它可逆地催化ATP上的γ磷酸基团转移到精氨酸上，从而形成ADP和一种具有高能键的储能分子——磷酸精氨酸[1]。反应方程式如下：

精氨酸+ATP·Mg磷酸精氨酸+ADP·Mg2++H+

精氨酸激酶属于磷酸原激酶家族。磷酸原激酶催化ATP的高能磷酸基团可逆地转移到生物体内天然的胍基化合物，从而在细胞内部进行能量转移，因此在无脊椎动物体内能量代谢、存储和利用方面发挥着重要的调节作用[2-3]。作为体内能量代谢的关键酶之一，精氨酸激酶广泛地参与了体内的能量代谢，同时还与胁迫应答、离子交换、免疫抗性等过程相关[4-8]。在无脊椎动物体内，精氨酸激酶的表达具有一定的时空特异性。精氨酸激酶在不同的组织中均有表达，特别是在能量需求较高的组织如脑、肌肉、神经元、复眼或精巢等组织中高量表达[9]。除此之外，精氨酸激酶在不同组织中的表达量还受到外界因素的调控，如蜕皮激素可能参与调控家蚕精氨酸激酶的表达，从而导致精氨酸激酶在熟蚕期表达量达到最大，在蛹期表达量下降[10]。与滞育型棉铃虫相比，在非滞育型棉铃虫脑中，精氨酸激酶具有更高的反应活性，表明精氨酸激酶可能参与了棉铃虫蛹期的发育调控[11]。在烟草夜蛾中，精氨酸激酶在中肠和腹足中高量表达，可能与营养消化吸收和运动相关[12]。

由于精氨酸激酶在生命活动过程中的重要作用，多种不同来源的精氨酸激酶基因被克隆和体外表达，其结构和功能的研究也不断深入。1995年，Ellington等首先克隆了美洲鲎精氨酸激酶基因，并对其序列进行了分析[13]。随后，Maleszka等克隆分析了蜜蜂的精氨酸激酶基因[14]。2006年，王华兵和徐豫松从家蚕中克隆了精氨酸激酶，并分析了其在不同组织和时期的表达特征[10]。之后，美洲大蠊[15]、蝗虫[16]、凡纳滨对虾[17-18]、家蚕[19]、棉铃虫[9-11,20-21]、海参[22]、锯缘青蟹[23]、烟草夜蛾[12]、捻转血矛线虫[24]等精氨酸激酶基因相继被克隆，并对其时空表达、结构活性等进行了研究。陈克平等发现家蚕精氨酸激酶在抗NPV的家蚕品种中高表达，推测其可能与家蚕抗NPV病毒相关[4]。

虽然家蚕精氨酸激酶的研究已经取得了一些进展，但对其分子结构和酶学性质则知之甚少。本文从家蚕中克隆了精氨酸激酶基因，并将其构建到原核表达载体，进行表达纯化。在此基础上，进一步分析了其酶学性质和蛋白结构，为深入理解其分子结构和生物学功能提供了基础。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

蛋白分子量marker、硫酸卡纳霉素(Kana)、T4 DNA连接酶购自TaKaRa宝生物工程 (大连) 有限公司；大肠杆菌DH5α和.Transetta (DE3) 购自北京全式金生物技术有限公司；dNTPs、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG) 购自上海生工；RⅠ、d Ⅲ和Q5高保真DNA聚合酶购自New England Biolabs公司；质粒抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒购自Axygen公司。感谢美国西南医学中心张学武教授馈赠表达载体pSKB2。pSKB2是基于pET-28a(+)改造的载体，将thrombin的酶切位点替换为prescission的酶切位点，其他保持不变。

1.2 生物信息学分析

利用家蚕基因组数据库SilkDB (http://silkdb.org/) 和Pubmed (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/pubmed/) 分析家蚕精氨酸激酶 (BmAK) 染色体定位、基因组DNA和mRNA序列，利用Protparam (http://web.expasy.org/ protparam/)分析BmAK蛋白分子量、等电点、结构域，并预测其二级结构和三级结构。以BmAK氨基酸序列为模板进行Blast分析，利用分子进化软件Mega[25]构建系统发育进化树。

1.3 表达载体构建

根据的cDNA序列，利用Primer Premier软件进行引物设计，正反向引物分别为5′-CCATGGTCGACGCCGCAACC-3′和5′-CGCCTACAGAGACTTCTCGATCTTGATGAGCT-3′，其中下划线部分分别表示RⅠ和d Ⅲ的酶切位点。以5龄3天家蚕后部丝腺组织cDNA (本实验室提供) 为模板，通过PCR扩增获得基因，利用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析。将扩增获得的DNA片段通过凝胶回收试剂盒纯化回收，将pSKB2载体与目标DNA片段同时进行RⅠ和d Ⅲ双酶切，再利用T4 DNA连接酶将二者连接。将连接产物转化DH5α，并通过菌落PCR、双酶切和基因测序对重组质粒进行验证。

1.4 蛋白原核表达

蛋白表达纯化参考之前的方案[26-28]，此处简述如下。选择正确的重组质粒转化Transetta (DE3) 细胞，首先挑取单菌落37 ℃过夜培养，然后接种到含有卡那霉素的LB培养基中培养至600约0.8–1.0，加入0.1 mmol/L IPTG在16 ℃和37 ℃、220 r/min转速下分别培养20 h和4 h诱导表达，4 ℃、12 000 r/min离心20 min收集菌体，加入缓冲液A (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，500 mmol/L NaCl，10% Glycerol) 悬浮细胞，冰浴超声破碎。破碎后的细胞于4 ℃、12 000 r/min离心，分别收集上清和沉淀，进行15% SDS-PAGE电泳。利用考马斯亮蓝染色分析不同培养温度下的表达情况。发现在两种温度下均在上清中表达，故选择37 ℃进行大量表达纯化。

1.5 重组蛋白的纯化

在37 ℃、220 r/min转速下，加入0.1 mmol/L IPTG诱导4 h以大量表达重组BmAK蛋白。收集细胞，冰浴超声破碎，然后在4 ℃、12 000 r/min离心20 min收集上清。利用0.45 μm滤膜对上清过滤，然后在4 ℃下进行Ni-NTA亲和层析纯化，利用包含不同咪唑浓度的缓冲液进行梯度洗脱，分别收集不同组分的洗脱液，进行15% SDS-PAGE分析。考马斯亮蓝染色后，选择条带单一的梯度洗脱液进行浓缩，并利用HiPrep 26/10 (GE Healthcare) 脱盐除去咪唑，同时置换为缓冲液B (20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，5%甘油)。收集脱盐后的蛋白溶液，浓缩后于–80 ℃冻存。

1.6 凝胶过滤分析

取冻存的重组BmAK蛋白，解冻后于4 ℃、12 000 r/min离心20 min，取上清载入Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) 凝胶层析柱进行凝胶过滤分析，上样体积0.5 mL，流速0.5 mL/min，流动相为缓冲液B。收集蛋白组分，进行15% SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析。

1.7 二级结构分析

利用Millipore超滤浓缩离心管将纯化的BmAK蛋白置换于磷酸缓冲液PBS中，然后借助圆二色光谱仪MOS-500 (Bio-Logic，法国) 对BmAK蛋白的二级结构进行分析。测试温度为25 ℃，波谱扫描范围为190–250 nm，所用比色皿光程为1 mm，蛋白浓度为0.1 mg/mL，扫描速度为240 nm/min。

分别将不同pH值的缓冲溶液与纯化的BmAK蛋白在室温下孵育30 min，然后利用MOS-500进行二级结构分析，以不含蛋白的相应pH缓冲溶液为空白对照。所有的实验重复3次，取平均值进行分析。

1.8 酶学活性检测

BmAK的酶学活性检测参考于振行等[29]。酶活反应体系如下：57 mmol/L精氨酸，66 mmol/L乙酸镁，2 mL溴百里酚蓝指示剂，53.2 mg ATP钠盐，反应总体积为20 mL。反应溶液现配现用，并利用NaOH调节pH到7.5，注意避光保存。反应溶液首先在30 ℃温育10 min，然后取1 mL反应液加入比色皿中，再加入10 μL纯化的 1 mg/mL BmAK，利用DU 800型紫外分光光度计 (BECKMAN，美国) 测定575 nm处吸光值在1 min中内下降的数值。重复上述实验，取 3次测定的平均值为BmAK的活性。

1.9 最适反应温度和热稳定性分析

将BmAK的酶活反应体系分别在10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃孵育10 min，然后再按照上述测活方法检测BmAK活性。以BmAK的最高反应活性为100%，其他温度下活性相对最高活性作图，从而确定BmAK的最适反应温度。接下来将BmAK溶液分别在10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃孵育10 min，然后在最适反应温度下测定BmAK的活性，从而分析BmAK的热稳定性。

1.10 最适反应pH和pH稳定性分析

将BmAK的酶活反应体系分别设定为pH 6.5、6.75、7.0、7.25、7.50、7.75和8.0的缓冲溶液，其他保持不变，然后再按照上述测活方法在最适温度下检测BmAK活性。以BmAK的最高反应活性为100%，其他pH下活性相对最高活性作图，从而确定BmAK的最适反应pH。接下来将BmAK分别在pH 6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的缓冲溶液中孵育10 min，然后在最适反应温度和最适反应pH下测定BmAK的活性，从而分析BmAK的pH稳定性。

2 结果与分析

2.1基因克隆与分析

根据家蚕基因组数据库和PubMed数据库，以5龄3天家蚕后部丝腺组织cDNA为模板，利用设计的引物进行PCR扩增，获得长度约为1 068 bp的序列。将获得的DNA片段与pSKB2载体通过双酶切后连接，转化DH5α，首先通过菌落PCR扩增验证，然后以RⅠ和d Ⅲ双酶切对构建成功的质粒验证 (图1A)，最后通过基因测序进一步确认克隆构建成功。

基因在GenBank数据库中的登录号为692924，该基因定位于家蚕第5号染色体 (图1B)。该基因全长11 377 bp，由3个外显子和2个内含子组成 (图1C)。mRNA全长1 285 bp，其中包括一段编码1 068 bp的开放阅读编码框 (ORF)，编码355个氨基酸。基因mRNA的5′末端存在一段长51 bp的非翻译区序列 (5′-UTR)，3′末端包含一段长148 bp的非翻译区序列 (3′-UTR) 和一段由17个A组成的polyA加尾信号 (图1D)。

2006年，王华兵等利用5′ RACE法从家蚕中克隆了基因[10,30]。该基因包含2个外显子和1个内含子，cDNA全长1 268 bp，编码355个氨基酸，GenBank登录号为DQ272299。与本文克隆的基因相比，二者在基因结构方面存在一定差异，但编码的氨基酸完全相同。这种基因结构的差异可能与家蚕的品种相关，本文采用的家蚕品种为大造，而王华兵等采用的家蚕品种为C108[10,30]。

2.2 BmAK蛋白结构分析

Protparam分析显示BmAK蛋白分子量约为40 kDa，等电点为5.87。利用在线服务器SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/) 分析发现BmAK蛋白包含两个典型的结构域，其中20–91位氨基酸残基组成了ATP-胍基磷酸转移酶N末端结构域，113–355位氨基酸残基组成了ATP-胍基磷酸转移酶结构域 (图2A)。利用Pubmed分析BmAK蛋白保守的结构域和关键氨基酸位点，发现BmAK属于磷酸原激酶超家族中类精氨酸激酶家族一员，其中第62–65位、67位、193位、224位、270位、272–273位、313–314位氨基酸残基被认为是与精氨酸结合的保守位点，第121位、123位、125位、184位、220位、228位、279位、281–283位、308位、310位、312–313位、323位被认为是与ADP结合的保守位点，第305–326位氨基酸残基形成了底物特异环 (图2B)。利用PSIPRED分析BmAK蛋白的结构，发现BmAK蛋白由2个显著的结构域组成，其中N末端结构域由6段短的α螺旋结构组成，C末端结构域由多段α螺旋和β片层结构组成 (图2C–D)。

2.3 BmAK蛋白系统进化分析

将BmAK氨基酸序列通过Pubmed提交进行BLAST分析，选取24种与BmAK序列同源的物种进行系统进化分析，结果如图3所示。进化树分析显示，家蚕BmAK与同为鳞翅目的冬尺蠖蛾、小菜蛾的精氨酸激酶序列相似度最高，暗示了这些物种的精氨酸激酶具有相似的进化起源。序列差异最大的是斑马鱼、小鼠和智人的肌酸激酶，显示了精氨酸激酶在不同物种中的进化差异。总体来看，精氨酸激酶在低等和高等生物中的序列相当保守，暗示了精氨酸激酶在低等和高等生物生命活动过程中都发挥着重要的功能。

图1 BmAK基因的克隆和分析(A：BmAK基因克隆、菌落PCR和双酶切验证；B：染色体定位；C：BmAK基因组DNA示意图；D：BmAK基因mRNA示意图)

图2 BmAK分析(A：结构域预测；B：保守结构域和关键氨基酸位点分析；C：预测的BmAK二级结构；D：预测的BmAK三级结构)

2.4 BmAK蛋白表达纯化

将克隆获得的基因与pSKB2载体连接，经双酶切和基因测序验证后，将正确构建的重组表达质粒pSKB2-转化Transetta (DE3) 表达细胞，在16 ℃和37 ℃下，分别加入0.1 mmol/L IPTG诱导含有6个组氨酸标签(6×His)的重组BmAK蛋白(6×His-BmAK，His6- BmAK) 表达。SDS-PAGE显示，无论在16 ℃还是37 ℃，上清中均存在一条约为43 kDa的明显蛋白条带，表明成功表达了重组His6-BmAK蛋白，且目的蛋白主要以可溶性蛋白的表达形式存在于细胞裂解后的上清中，在沉淀中几乎看不到目的蛋白的条带 (图4A)。因此，我们选择在37 ℃下培养细胞诱导目的蛋白的表达。

在37℃下，加入0.1 mmol/L IPTG大规模诱导重组BmAK蛋白表达，然后在4℃下通过Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白，分别利用包含20–500 mmol/L咪唑浓度的缓冲溶液梯度洗脱。SDS-PAGE结果显示，大多数洗脱组分获得的目的蛋白纯度都超过了90%，其中包含 500 mmol/L咪唑的缓冲溶液洗脱的目的蛋白纯度超过了98% (图4B)。收集包含500 mmol/L咪唑的缓冲溶液洗脱的His6-BmAK蛋白，脱盐浓缩后冻存于–80℃。

图3 BmAK与其他物种同源蛋白的进化分析

图4 BmAK表达纯化(A：BmAK表达分析；B：Ni-NTA亲和层析纯化BmAK)

2.5 BmAK蛋白溶液存在形式分析

将纯化的BmAK蛋白通过凝胶过滤层析柱分析BmAK在溶液中的存在形式，结果如图5A所示。BmAK流经Superdex 200 10/300 GL凝胶层析柱，显示为一个单一锐利的对称峰形。SDS-PAGE结果显示，该峰代表的为重组His6-BmAK蛋白 (图5B)。根据图5A的洗脱体积，可以推算出重组His6-BmAK在溶液中的分子量约为43 kDa，表明重组表达的His6-BmAK蛋白在溶液中主要以单体的形式存在。

图5 BmAK在溶液中的存在形式分析(A：凝胶过滤层析分析；B：SDS-PAGE分析洗脱物)

2.6 BmAK蛋白二级结构分析

通过圆二色光谱法分析BmAK蛋白的二级结构，结果显示，BmAK蛋白的圆二色光谱在约208 nm和222 nm处具有两个明显的负峰，在约192 nm处具有一个明显的正峰 (图6A)，表明获得的重组BmAK蛋白含有一定的α螺旋结构，这与之前BmAK蛋白结构预测的结果基本一致。利用软件Biokine v4.74可以计算出BmAK中α螺旋、β折叠链和无规则卷曲结构的含量分别约为32%、8%和60%，因此BmAK的圆二色光谱图显示出α螺旋结构的特征峰，β折叠链和无规则卷曲结构的特征峰在圆二色光谱图中表现不明显。

利用圆二色光谱法进一步分析不同pH的缓冲溶液对BmAK蛋白二级结构的影响，结果如图6B所示。从图中可以看出，随着pH值的改变，BmAK圆二色光谱图中α螺旋结构的特征峰发生了显著的改变。由于β折叠链和无规则卷曲结构的特征峰在BmAK的圆二色光谱图中表现不明显，因此，直接利用圆二色光谱研究pH对BmAK蛋白中β折叠链和无规则卷曲结构的影响较为困难，但这并非意味着pH值的改变不会影响β折叠链和无规则卷曲结构。本文以222 nm处的椭圆度值222来表征BmAK的α螺旋结构，以222对不同的pH作图，从而反映pH对BmAK蛋白α螺旋结构的影响 (图6C)。结果显示，222在pH 5–10的缓冲溶液中变化不大，表明在pH 5–10的缓冲溶液中，BmAK蛋白的α螺旋结构含量相对稳定，基本不受pH变化的影响。当pH<5时，随着pH的下降，222值升高，指示BmAK蛋白的α螺旋结构受pH影响，逐渐减少；当pH>10时，随着pH的升高，222值快速升高，表明在碱性条件下，进一步升高溶液pH，诱导了BmAK蛋白的α螺旋结构迅速减少。

2.7 最适反应温度和热稳定性

在不同的温度下分别检测BmAK活性，从而测定其最适反应温度，结果如图7A所示。结果显示，大约30 ℃时BmAK的活性最高。当温度低于30 ℃时，随着温度的升高，BmAK的活性快速升高，表明温度促进了BmAK催化反应的进行；当温度高于30 ℃时，随着温度的升高，BmAK的活性逐渐下降，直至80 ℃时活性降低至最高活性的约5%左右。升高温度一方面可以加速BmAK催化反应的进行，另一方面也可能引起BmAK构象发生变化从而导致活性丧失。从30 ℃升高温度到80 ℃的过程中，高温导致的失活效应要比其促进效应显著，从而导致了BmAK催化活性的下降。因此，BmAK的最适反应温度约为30 ℃。

将BmAK在不同的温度下孵育10 min，然后在最适温度下检测其活性，从而分析BmAK的热稳定性，结果如图7B所示。25 ℃时BmAK的活性最高，其次是20 ℃和30 ℃，分别约为最高活性的99.52%和98.96%。15 ℃时BmAK的活性约为最高活性的98.32%，5 ℃时BmAK的活性约为最高活性的87.94%，35 ℃和40 ℃时BmAK的活性约为最高活性的95%。当温度升高到50 ℃时，BmAK的活性迅速降至其最高活性的70%左右。在5–25 ℃温度范围内，BmAK蛋白的结构相对稳定，逐渐升高温度可以促进BmAK催化反应的进行，因此在25 ℃时BmAK的活性达到最大值；当温度超过25 ℃时，进一步升高温度会引起BmAK的结构变化，从而导致其活性下降。总体来看，在15–30 ℃的范围内，BmAK的活性变化不大，表明其结构在此温度区间相对稳定。

2.8 最适反应pH和pH稳定性

在不同pH的溶液中分别检测BmAK的活性，从而测定BmAK的最适反应pH，结果如图8A所示。pH 7.5时，BmAK的活性最高；pH 6.5时，其活性仅为最高活性的约25%。随着pH值逐渐从6.5升高到7.5，BmAK的活性逐渐升高；当进一步升高pH到8.0时，BmAK的活性降至最高活性的约65%。这些结果表明，BmAK的最适反应pH为7.5。

将BmAK在不同pH的缓冲溶液中孵育 10 min，然后在pH 7.5和30 ℃下分别检测其活性，从而分析BmAK在不同pH下的稳定性，结果如图8B所示。在pH 7.0，BmAK具有最高的活性；pH 6.0时其活性约为最高活性的30%；随着pH从7.0升高到8.0，BmAK的活性快速下降至其最高活性的约50%，进一步增加pH到11.0，BmAK的活性持续下降至其最高活性的约15%。这些结果表明，pH对BmAK的结构具有一定的影响。在pH 7.0左右，BmAK的结构相对稳定。

图7 最适反应温度和热稳定性分析(A：BmAK的最适反应温度分析；B：BmAK的热稳定性分析)

图8 最适反应pH和pH稳定性分析(A：BmAK的最适反应pH分析；B：BmAK的pH稳定性分析)

3 讨论

精氨酸激酶是无脊椎动物体内一类重要的磷酸原激酶，在能量代谢、贮藏和利用方面发挥关键的调控作用。AK在不同的组织中均有表达，但在能量需求较高的组织中表达尤其显 著[10-14,31-32]。昆虫是自然界种类和数量最多的无脊椎动物，具有重要的经济和科学研究价值。AK是参与昆虫能量代谢的关键酶。除参与昆虫肌肉能量供应，AK还与昆虫的发育、繁殖、运动、免疫和抗性等密切有关。当前，AK的研究主要集中在贝类、虾、螃蟹、海参等动物和锥体虫、线虫等寄生虫。昆虫AK的研究主要围绕其cDNA序列特征[10]、时空表达特征[9-10,12-14,21-29,31]、生长发育调控[11]、免疫应答[4,8,15]和环境适应[33]等问题，关于其分子结构和酶学性质则很少涉 及[24,34-35]。

本研究从5龄3天家蚕后部丝腺组织中克隆获得了ORF序列，分析了基因的染色体定位、基因组DNA结构、mRNA结构及其蛋白二级和三级结构。BmAK包含两个保守的结构域，ATP-胍基磷酸转移酶N末端结构域和ATP-胍基磷酸转移酶结构域，其中N末端结构域由6段短α螺旋结构组成，ATP-胍基磷酸转移酶结构域由多股α螺旋结构包裹的β片层结构组成。BmAK具有精氨酸激酶共有的活性中心序列CPTNLGT及关键的D61和R192残基[36-37]，与其他昆虫AK的氨基酸序列高度相似，与脊椎动物肌酸激酶的序列也具有较高的同源性，暗示了它们在体内可能对能量代谢具有相似的调控功能。

原核表达分析显示，BmAK主要在上清中以可溶性蛋白的形式表达，暗示了其可能折叠形成了正确的空间结构。酶分子折叠形成正确的空间构象对于其催化活性至关重要。酶学活性检测显示重组表达的BmAK具有良好的催化活性。凝胶过滤层析分析揭示了重组表达的BmAK在溶液中以单体结构的形式存在，这与大多数昆虫AK的结构一致[38]。圆二色光谱分析表明，BmAK蛋白包含有α螺旋结构，证实了之前生物信息学预测的结果，同时也表明重组表达的BmAK可以折叠形成正确的空间构象。BmAK酶活的最适温度为30 ℃，最适pH为7.5，这与家蚕最适饲育温度22–28 ℃基本一致。在15–30 ℃范围内，BmAK的活性变化不大 (图7B)，表明在此温度区间BmAK的结构相对稳定；同时，作为家蚕体内与能量代谢相关的关键酶，BmAK的酶学活性可能不会影响家蚕在15–30 ℃范围内的生命活动。对比pH对BmAK二级结构 (图6B) 和酶学活性 (图8B) 的影响，可以发现在pH 5–10范围内BmAK的二级结构并没有发生显著的改变，但BmAK的酶学活性则改变了很多，表明在酶分子的结构发生明显改变之前，其活性中心的构象已经发生了显著的变化，这与邹承鲁先生之前提出的著名论断“酶活性部位构象变化发生在整体构象变化之前”一致[39]。

根据蛋白分子量和结构，精氨酸激酶一般被分为3类：单亚基、双亚基和四亚基[22]。昆虫AK多属于单亚基精氨酸激酶，海参AK属于双亚基精氨酸激酶。海参AK的N末端序列和W218、W208残基对其结构稳定性和酶学活性具有至关重要的作用[40]。金属离子对AK的催化反应非常关键，不同的离子种类对不同物种的AK作用机制也不相同。Mn2+和Mg2+对蝗虫AK[16]和龙虾AK[41]的酶活具有激活效应，而Zn2+和Cu2+则对蝗虫AK的酶活具有抑制作 用[16]。Mn2+和Cu2+可以完全抑制凡纳滨对虾AK的酶活。这些发现表明尽管精氨酸激酶在进化过程中氨基酸序列高度保守，但不同的生活环境可能也对不同物种来源的AK蛋白结构和酶学活性产生一定的影响。

本研究克隆了家蚕基因，并成功获得了可溶的、具有酶学活性的BmAK蛋白，对其蛋白结构和酶学性质开展了初步的研究，为深入研究其活性位点构象、关键氨基酸残基、激活剂和抑制剂等建立了基础。AK是无脊椎动物包括鳞翅目昆虫特有的能量代谢相关的关键酶。多数的农林害虫属于鳞翅目昆虫。家蚕是鳞翅目昆虫研究的模式动物。因此，深入研究BmAK的结构和酶学性质，有助于揭示AK在鳞翅目昆虫体内的生理功能和调控机制，从而在此基础上筛选AK酶活性抑制剂，开发以AK为害虫防控分子靶标的绿色安全环保的新型杀虫剂。

REFERENCES

[1] Ellington WR. Evolution and physiological roles of phosphagen systems. Annu Rev Physiol, 2001, 63: 289–325.

[2] Smith E, Morrison JF. Kinetic studies on the arginine kinase reaction. J Biol Chem, 1969, 244(15): 4224–4234.

[3] Hird FJR. The importance of arginine in evolution. Comp Biochem Physiol B, 1986, 85(2): 285–288.

[4] Kang LQ, Shi HF, Liu XY, et al. Arginine kinase is highly expressed in a resistant strain of silkworm (, Lepidoptera): implication of its role in resistance tonucleopolyhedrovirus. Comp Biochem Physiol B, 2011, 158(3): 230–234.

[5] Liu Z, Xia L, Wu Y, et al. Identification and characterization of an arginine kinase as a major allergen from silkworm () larvae. Int Arch Allergy Immunol, 2009, 150(1): 8–14.

[6] Pereira CA. Arginine kinase: a potential pharmacological target in trypanosomiasis. Infect Disord Drug Targets, 2014, 14(1): 30–36.

[7] Qin LG, Xia HC, Shi HF, et al. Comparative proteomic analysis reveals that caspase-1 and serine protease may be involved in silkworm resistance tonuclear polyhedrosis virus. J Proteomics, 2012, 75(12): 3630–3638.

[8] Tanaka H, Ishibashi J, Fujita K, et al. A genome-wide analysis of genes and gene families involved in innate immunity of. Insect Biochem Mol Biol, 2008, 38(12): 1087–1110.

[9] Zhao J, Cheng TT, Huang LN, et al. Expression profile of arginine kinase from. J Agric Biotech, 2016, 24(3): 397–405 (in Chinese). 赵洁, 程婷婷, 黄丽娜, 等. 棉铃虫精氨酸激酶(AK) 的表达规律. 农业生物技术学报, 2016, 24(3): 397–405.

[10] Wang HB, Xu YS. cDNA cloning, genomic structure and expression of arginine kinase gene from(L.). Sci Agric Sin, 2006, 39(11): 2354–2361 (in Chinese). 王华兵, 徐豫松. 家蚕精氨酸激酶基因的克隆、基因结构与表达分析. 中国农业科学, 2006, 39(11): 2354–2361.

[11] Bao B, Xu WH. Identification of gene expression changes associated with the initiation of diapause in the brain of the cotton bollworm,. BMC Genomics, 2011, 12: 224.

[12] Zhang YC, An SH, Li WZ, et al. Cloning and mRNA expression analysis of arginine kinase gene from(Guenée) (Lepidoptera: Noctuidae). Acta Entomol Sin, 2011, 54(7): 754–761 (in Chinese). 张元臣, 安世恒, 李为争, 等. 烟夜蛾精氨酸激酶基因的克隆及mRNA表达分析. 昆虫学报, 2011, 54(7): 754–761.

[13] Strong SJ, Ellington WR. Isolation and sequenceanalysis of the gene for arginine kinase from the chelicerate arthropod,: insights into catalytically important residues. Biochim Biophys Acta, 1995, 1246(2): 197–200.

[14] Kucharski R, Maleszka R. Arginine kinase is highly expressed in the compound eye of the honey-bee,. Gene, 1998, 211(2): 343–349.

[15] Chen JJ, Xia LX, Liu ZG, et al. Cloning, expression and purification of allergen arginine kinase fromand its allergic activity. Chin J Parasitol Parasit Dis, 2008, 26(5): 356–360 (in Chinese). 陈家杰, 夏立新, 刘志刚, 等. 美洲大蠊精氨酸激酶基因的克隆、表达及变应原活性测定. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2008, 26(5): 356–360.

[16] Zhu WJ. Modification and inhibition of arginine kinase from Locust [D]. Tai’an: Shandong Agricultural University, 2008 (in Chinese). 朱雯静.蝗虫精氨酸激酶的活性中心及其抑制剂研究[D]. 泰安: 山东农业大学, 2008.

[17] Yao CL, Wang ZY, Xiang JH. Structure and function of arginine kinase in crustacean. Chin J Biochem Mol Biol, 2008, 24(3): 203–208 (in Chinese). 姚翠鸾, 王志勇, 相建海. 甲壳动物精氨酸激酶的结构与功能. 中国生物化学与分子生物学报, 2008, 24(3): 203–208.

[18] Yao CL, Ji PF, Kong P, et al. Preparation of polyclonal antibody and analysis of tissue specific expression of arginine kinase protein in. J Fish Chin, 2009, 33(6): 1026–1030 (in Chinese). 姚翠鸾, 冀培丰, 孔鹏, 等. 凡纳滨对虾精氨酸激酶的多克隆抗体制备及组织特异性表达分析. 水产学报, 2009, 33(6): 1026–1030.

[19] Kang LQ, Shi HF, Wang N, et al. Cloning, purification and characterization of recombinant silkworm arginine kinase expressed in. Afr J Biotechnol, 2011, 10(36): 7026–7033.

[20] Su XF. The Expression and regulation of L-arginine kinase in[D].Beijing: Chinese Academy of Agriculture Sciences, 2011 (in Chinese). 苏晓峰.精氨酸激酶在棉铃虫中的表达及调控研究[D]. 北京: 中国农业科学院, 2011.

[21] Zhao YY, Wu WF, Wang XD, et al. Protein expression of arginine kinase and Real-time PCR analysis. J Shihezi Univ, 2013, 31(1): 6–9 (in Chinese).赵伊英, 武万峰, 汪小东, 等. 精氨酸激酶基因的蛋白表达及实时荧光定量分析. 石河子大学学报, 2013, 31(1): 6–9.

[22] Liu TT, Wang XC. Effects of Cu2+on Arginine kinase: activity changes, conformational changes, and aggregation. Mar Sci, 2011, 35(1): 17–21 (in Chinese). 刘陶陶, 王希成. 铜离子对海参精氨酸激酶活力与结构的影响. 海洋科学, 2011, 35(1): 17–21.

[23] Ruan WW, Shen Y, Cao MJ, et al. Cloning and expression of arginine kinase from Mud Crab (). J Jimei Univ: Nat Sci, 2011, 16(5): 346–351 (in Chinese). 阮韦伟, 沈苑, 曹敏杰, 等. 锯缘青蟹精氨酸激酶基因的克隆与表达. 集美大学学报: 自然科学版, 2011, 16(5): 346–351.

[24] Ma CX, Zhang ZC, Li XR, et al. Arginine kinase in: cloning, expression and catalytic properties. J Nanjing Agric Univ, 2014, 37(3): 100–106 (in Chinese). 马春晓, 张振超, 李祥瑞, 等. 捻转血矛线虫精氨酸激酶基因的克隆与表达及酶活性分析. 南京农业大学学报, 2014, 37(3): 100–106.

[25] Kumar S, Stecher G, Tamura K. Mega7: molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Mol Biol Evol, 2016, 33(7): 1870–1874.

[26] Wang YJ, Liu LN, Gao CY, et al. Cloning, expression and characterization of silk gland factor SGF-1 of. Sci Sericult, 2016, 42(2): 219–227 (in Chinese). 王叶菁, 刘莉娜, 高春雁, 等. 家蚕丝腺因子sgf-1的基因克隆及序列结构和表达特征与亚细胞定位. 蚕业科学, 2016, 42(2): 219–227.

[27] He HW, Wei SG, Wang YJ, et al. Soluble expression, purification and structural analysis of the bHLH transcription factor Bmsage of.Chin J Biotech, 2016, 32(10): 1395–1407 (in Chinese). 何华伟, 位曙光, 王叶菁, 等. 家蚕bHLH转录因子Bmsage可溶性表达、纯化与结构分析. 生物工程学报, 2016, 32(10): 1395–1407.

[28] Zhao P, Wang YJ, Wei SG, et al. Interaction of bHLH transcription factor bmdimm and bmchip in.Sci Agric Sin, 2016, 49(10): 2027–2038 (in Chinese). 赵朋, 王叶菁, 位曙光, 等. 家蚕bHLH转录因子Bmdimm与Bmchip的相互作用. 中国农业科学, 2016, 49(10): 2027–2038.

[29] Yu Z, Pan J, Zhou HM. A direct continuous pH-spectrophotometric assay for arginine kinase activity. Protein Pept Lett, 2002, 9(6): 545–552.

[30] Wang HB, Xu YS. cDNA cloning, genomic structure and expression of arginine kinase gene from. Advanced seminar of sericulture biotechnology and silkworm disease control, selected proceedings of the symposium in silkworm physiology, pathology and biotechnology, 2006, 2354–2361 (in Chinese). 王华兵, 徐豫松. 家蚕精氨酸激酶基因的克隆、基因结构与表达分析. “蚕业生物技术与家蚕病害控制”高级研讨班、“家蚕生理、病理和生物技术”学术研讨会论文选集, 2006, 2354–2361.

[31] Wang YE, Esbensen P, Bentley D. Arginine kinase expression and localization in growth cone migration. J Neurosci, 1998, 18(3): 987–998.

[32] Yao CL, Ji PF, Kong P, et al. Arginine kinase from: cloning, expression and catalytic properties. Fish Shellfish Immunol, 2009, 26(3): 553–558.

[33] Miranda MR, Canepa GE, Bouvier LA, et al.: oxidative stress induces arginine kinase expression. Exp Parasitol, 2006, 114(4): 341–344.

[34] Zhang YC, An SH, Yuan GH. Advances in research on arginine kinase in insects. Chin Bull Entomol, 2013, 50(2): 533–538 (in Chinese). 张元臣, 安世恒, 原国辉. 昆虫精氨酸激酶的研究进展. 应用昆虫学报, 2013, 50(2): 533–538.

[35] Huang LN, Liu N, Zhao J, et al. The research prospect of arginine kinase. Life Sci Res, 2015, 19(5): 452–456 (in Chinese). 黄丽娜, 刘宁, 赵洁, 等. 精氨酸激酶研究进展. 生命科学研究, 2015, 19(5): 452–456.

[36] Takeuchi M, Mizuta C, Uda K, et al. Unique evolution of bivalvia arginine kinases. Cell Mol Life Sci, 2004, 61(1): 110–117.

[37] Fujimoto N, Tanaka K, Suzuki T. Amino acid residues 62 and 193 play the key role in regulating the synergism of substrate binding in oyster arginine kinase. FEBS Lett, 2005, 579(7): 1688–1692.

[38] Brown AE, France RM, Grossman SH. Purification and characterization of arginine kinase from the american cockroach (). Arch Insect Biochem Physiol, 2004, 56(2): 51–60.

[39] Tsou CL. Conformational flexibility of enzyme active sites. Science, 1993, 262(5132): 380–381.

[40] Guo Q, Zhao F, Guo SY, et al. The tryptophane residues of dimeric arginine kinase: roles of trp-208 and trp-218 in active site and conformation stability. Biochimie, 2004, 86(6): 379–386.

[41] Zhou Q, Wu CG, Dong B, et al. Proteomic analysis of acute responses to copper sulfate stress in larvae of the brine shrimp,. Chin J Oceanol Limnol, 2010, 28(2): 224–232.

(本文责编 郝丽芳)

Prokaryotic expression, purification and characterization of arginine kinase of

Huawei He1, Yejing Wang2, Minjian Zhao2, Shuguang Wei1, Peng Zhao1, Wenchao Jiang1, Li’na Liu1, and Ping Zhao1

1 State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Southwest University, Chongqing 400715, China 2 College of Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China

Arginine kinase (AK) is a key enzyme in energy metabolism of invertebrates and plays an important regulatory role in the life activities such as growth and development, nutrition utilization, immune resistance and stress response. Arginine kinase of(BmAK) is related to the energy balance and anti-NPV process, but there is little research on its molecular structure and enzymatic properties. We cloned the ORF sequence ofgene, and analyzed chromosomal localization, genomic structure, mRNA structure, secondary and tertiary structure. Phylogenetic analysis indicated that AK was highly conserved in evolution. Soluble recombinant BmAK was obtained by prokaryotic expression, and purified by Ni-NTA affinity chromatography. The circular dichroism spectroscopy showed that BmAK contained α-helix structures, and its α-helix structures were relatively stable in the pH range between 5 and 10. Enzyme activity analysis showed that the optimum temperature of BmAK was 30 ℃ and the optimum pH of BmAK was 7.5. The optimal temperature of BmAK was 25 ℃. Between 15 ℃ and 30 ℃, the structure and activity of BmAK was relatively stable. The structure of BmAK was relatively stable at pH 7.0. Our findings reveal the structure and function of BmAK to develop novel green safe and environmentally friendly insecticides.

, arginine kinase, expression and purification, structure, activity

January 5, 2017; Accepted:April 27, 2017

Yejing Wang. Tel: +86-23-68251575; E-mail: yjwang@swu.edu.cn

Supported by:National Natural Science Foundation of China (Nos. 31402139, 31572465), State Key Program of National Natural Science of China (No. 31530071), Chongqing Research Program of Basic Research and Frontier Technology (Nos. cstc2015jcyjA00040, cstc2015jcyjBX0035), Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. XDJK2013A019), Start-up Grant from Southwest University (No. SWU112111).

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网络出版时间：2017-05-17

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170517.1450.002.html