利用餐厨垃圾渗滤液培养苏云金芽孢杆菌

申丽君，段冉冉，张志强，许倩倩，吕 乐，刘晓璐，尹春华，张海洋，闫 海*

(1.北京科技大学化学与生物工程学院，北京 100083；2.北京绿色空间生物科技股份有限公司，北京 100097)



利用餐厨垃圾渗滤液培养苏云金芽孢杆菌

申丽君1，段冉冉1，张志强2，许倩倩1，吕 乐1，刘晓璐1，尹春华1，张海洋1，闫 海1*

(1.北京科技大学化学与生物工程学院，北京 100083；2.北京绿色空间生物科技股份有限公司，北京 100097)

以餐厨垃圾渗滤液为培养基，研究了苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)的培养条件及其去除餐厨垃圾渗滤液中主要营养成分的优化控制条件。结果表明，当餐厨垃圾渗滤液体积分数在25%～100%范围内时，随餐厨垃圾渗滤液体积分数的增大，Bt生物量增大，Bt菌落形成单位升高，72 h达到4.5×107CFU·mL-1，对餐厨垃圾渗滤液中总有机碳(TOC)和总氮(TN)的去除率分别达到48.8%和52.4%。在餐厨垃圾渗滤液中添加1 g·L-1KH2PO4和1 g·L-1MgSO4分别作为磷源和硫源，可以促进Bt的生长，72 h菌落形成单位达到1.4×108CFU·mL-1。表明利用餐厨垃圾渗滤液可以高效培养生物农药Bt，是废弃物高效资源化利用的有效途径，具有重要的应用价值。

苏云金芽孢杆菌；餐厨垃圾渗滤液；培养；处理

随着我国经济的快速发展和人们生活水平的提高，餐厨垃圾不断增加。餐厨垃圾中含有75%～ 90%的水分，成分复杂，易腐败并滋生细菌，如不进行处理，不仅污染环境，还严重威胁人类健康，导致大量生物质能的浪费[1-3]。餐厨垃圾渗滤液是指餐厨垃圾在压实、发酵等生物化学降解以及降水、地下水的渗流作用下产生的一种高浓度有机废水[4-5]。餐厨垃圾渗滤液的高效资源化利用是一个亟待解决的关键问题。目前，餐厨垃圾的主要处理方法包括物理化学法、填埋法和生物法等[6]，其中生物法主要包括堆肥制腐殖酸、发酵制氢、产甲烷、生产燃料乙醇及降解性塑料等[1]。

生物农药苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)对鳞翅目、鞘翅目、膜翅目和双翅目等32个科50多种昆虫害虫有不同程度的致病和毒杀作用[7]，且专一性高、对人畜无害、防治效果好，占微生物杀虫剂生产与销售总量的95%以上[8-10]，在农业虫害防治中发挥着重要作用。目前，沼渣、昆虫尸体、酒糟酒曲、红三叶鲜青草预加工废水和餐厨垃圾[11-14]等有机废弃物均可作为培养基原料培养Bt，但利用餐厨垃圾渗滤液作为培养基培养Bt的研究还未见报道。 作者以餐厨垃圾渗滤液为培养基，研究了Bt培养条件和去除餐厨垃圾渗滤液中主要营养成分的优化控制条件，以期为高效资源化利用餐厨垃圾渗滤液提供帮助。

1 实验

1.1 材料与菌种

餐厨垃圾渗滤液，北京绿色空间生物科技股份有限公司；苏云金芽孢杆菌NBIV-330，湖北康欣农用药业有限公司。

1.2 培养基

种子培养基根据文献[15]配制，餐厨垃圾渗滤液经滤膜过滤后，用Na2CO3调节pH值为6.6～6.8。

含不同体积分数餐厨垃圾渗滤液的液体培养基，121 ℃高温高压灭菌20 min。

1.3 方法

1.3.1 餐厨垃圾渗滤液的预处理

因餐厨垃圾渗滤液原液中不溶物较多，因此需对其进行预处理：将餐厨垃圾渗滤液在10 000 r·min-1下离心5 min，取上清液过15～20 μm中速滤膜，即得澄清餐厨垃圾渗滤液。

1.3.2 Bt培养条件

100 mL三角瓶，装液量20 mL，接种量1%(体积分数),设置3个平行样。培养温度35 ℃，摇床转速200 r·min-1。实验开始后，每天取样在722S型分光光度计上测定光密度(OD680)。采用牛肉膏蛋白胨固体培养基，涂布平板法测定Bt菌落形成单位(CFU)。

1.3.3 分析检测

取Bt培养物，于5 000 r·min-1离心10 min，取上清液，经0.22 μm滤膜过滤后在TOC仪(岛津公司，TOC-V CPH)上测定总有机碳(TOC)和总氮(TN)浓度，采用电导率仪(EUTECH公司，CON510)测定盐度。

2 结果与讨论

2.1 餐厨垃圾渗滤液原液的理化指标

餐厨垃圾渗滤液原液中TOC和TN分别高达20.1 g·L-1和0.9 g·L-1，碳氮比为22.3，比较符合微生物生长的营养元素要求。由于餐厨垃圾渗滤液来源于食物废弃物，所以微生物可利用的淀粉和蛋白等含量丰富[14]，为Bt的生长提供了必要且丰富的营养物质。餐厨垃圾渗滤液原液盐度高达61‰，高盐度培养基不利于氧的传递，对微生物的生长产生一定的抑制作用[16]。餐厨垃圾渗滤液原液pH值为3.4，由于Bt最适生长pH值为中性或偏碱性，因此需调节pH值接近中性。

2.2 温度对Bt生长的影响(图1)

图1 温度对Bt生长的影响Fig.1 Effect of temperature on the growth of Bt

从图1a可知，Bt在35～41 ℃范围内均可生长，但温度越低，Bt的生长速度越快、生物量越大，35 ℃时OD680最高达到9.1，与杨航聪等[15]对苏云金芽孢杆菌MS7的研究结果一致。孙翠霞等[17]指出Bt的最适生长温度为(30±1) ℃。每种微生物都有最适生长温度，同种微生物在不同的培养基中生长的最适温度也有差别。可能是因为温度直接影响细菌的酶反应体系，从而影响细菌对营养物质的吸收与利用，是影响Bt生长的重要因素。温度过高导致Bt毒力效价降低，温度过低则导致酶活性降低，代谢减缓，生长周期延长，产量降低[18]。因此后续实验采用35 ℃培养Bt。

2.3 Bt的生长和对TOC、TN的去除(图2)

图2 Bt的生长和对TOC与TN的去除Fig.2 The growth of Bt and removal of TOC and TN

从图2a可以看出，餐厨垃圾渗滤液体积分数越大，所获得的Bt生物量越大，以100%餐厨垃圾渗滤液为培养基时，OD680最高达到8.8；以50%和25%餐厨垃圾渗滤液为培养基时，OD680最高分别为5.8和2.9。说明餐厨垃圾渗滤液所含营养物质丰富，有利于Bt的快速生长。

从图2b可以看出，培养72 h，Bt的菌落形成单位随餐厨垃圾渗滤液体积分数的增大而升高，最高可达4.5×107CFU·mL-1。用SPSS软件对其进行统计学分析，结果表明：不同体积分数餐厨垃圾渗滤液的P<0.01，说明餐厨垃圾渗滤液体积分数对Bt的菌落形成单位有极显著影响。

从图2c、d可以看出，随着Bt的生长，餐厨垃圾渗滤液中的TOC、TN去除效果明显。当采用100%餐厨垃圾渗滤液为培养基时，TOC去除率最高达48.8%，TN去除率最高达52.4%；当餐厨垃圾渗滤液体积分数为50%时，TOC和TN去除率有所降低，当餐厨垃圾渗滤液体积分数降至25%时，TOC和TN去除率进一步下降。表明，餐厨垃圾渗滤液的体积分数越高，营养物质越丰富，不仅Bt的生物量越大，而且对TOC与TN的去除率也越高。从图2c还可以看出，培养60 h后Bt进入生长衰亡期，形成芽孢且芽孢囊脱落，菌体内容物释放，导致TOC有所上升。

2.4 外加磷源和硫源对Bt生长的影响(图3)

在基础培养基中额外添加1 g·L-1KH2PO4作为磷源和1 g·L-1MgSO4作为硫源后，Bt的生长量明显升高，培养48 hOD680达到最高，为11.5(图3a);72 h时的菌落形成单位为1.4×108CFU·mL-1，比空白对照组的Bt菌落形成单位4.8×107CFU·mL-1提高了约3倍(图3b)。表明，在餐厨垃圾渗滤液中补充磷源和硫源对Bt的生长有明显的促进作用。另外，经SPSS软件对两组的显著性差异进行统计学分析，最终得到P<0.01，说明在餐厨垃圾渗滤液中添加1 g·L-1KH2PO4和1 g·L-1MgSO4可以极明显促进Bt的生长，与黄勤清等[19]发现的添加KH2PO4和MgSO4可增加Bt的菌落数以及Ozkan等[20]报道的较高浓度的无机磷可以提高Bt的杀虫毒性相符。

图3 外加磷源和硫源对Bt生长的影响Fig.3 Effect of additional phosphorus source and additional sulfur source on the growth of Bt

3 结论

以餐厨垃圾渗滤液为培养基，研究了苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)培养条件和去除餐厨垃圾渗滤液中主要营养成分的优化控制条件。结果表明，当餐厨垃圾渗滤液体积分数在25%～100%范围内时，随餐厨垃圾渗滤液体积分数的增大，Bt生物量增大，Bt菌落形成单位升高，72 h达到4.5×107CFU·mL-1，对餐厨垃圾渗滤液中TOC和TN的去除效果也升高，去除率分别达到48.8%和52.4%。在餐厨垃圾渗滤液中添加1 g·L-1KH2PO4和1 g·L-1MgSO4分别作为磷源和硫源，可以促进Bt的生长，72 h菌落形成单位达到1.4×108CFU·mL-1。

[1] 孙媛媛，许鹏，刘丽清，等.餐厨垃圾资源化技术研究探析[J].环境科学与管理，2014，39(2)：174-177.

[2] RIKAME S S，MUNGRAY A A，MUNGRAY K.Electricity generation from acidogenic food waste leachate using dual chamber mediator less microbial fuel cell[J].International Biodeterioration & Biodegradation，2012，75：131-137.

[3] LI X M，CHENG K Y，WONG J W.Bioelectricity production from food waste leachate using microbial fuel cells：effect of NaCl and pH[J].Bioresource Technology，2013，149：425-458.

[4] 陈雪.浅析餐厨垃圾无害化处理中渗滤液的处理技术[J].环境科学与管理，2010，35(6)：99-101.

[5] 王亚光，吴玉先，滕瑶，等.餐厨垃圾渗滤液的基本特性分析[J].吉首大学学报(自然科学版)，2016，37(1)：69-73.

[6] 何则强，滕瑶，胡文勇，等.高铁酸钾的超声辅助化学合成及其对餐厨垃圾渗滤液的处理效果[J].环境工程学报，2016，10(2)：551-558.

[7] BENOIT T G，WILSON G R，BAUGH C L.Fermentation during growth and sporulation ofBacillusthuringiensisHD-1[J].Letters in Applied Microbiology，1990，10(1)：15-18.

[8] YILMAZ S，AVYAZ A，AKBULUT M，et al.A novelBacillusthuringiensisstrain and its pathogenicity against three important pest insects[J].Journal of Stored Products Research，2012，51：33-40.

[9] VACHON V，LAPRADE R，SCHWARTZ J L.Current models of the mode of action ofBacillusthuringiensisinsecticidal crystal proteins：a critical review[J].Journal of Invertebrate Pathology，2012，111(1)：1-12.

[10] 姚伟芳，弓爱君，邱丽娜，等.苏云金芽孢杆菌固态发酵条件的优化[J].化学与生物工程，2006，23(11)：42-44.

[11] 张玮玮，弓爱君，邱丽娜，等.以沼渣为原料固态发酵生产Bt生物农药[J].农业工程学报，2013，29(8)：212-217.

[12] 关雄，蔡峻.我国苏云金杆菌研究60年[J].微生物学通报，2014，41(3)：459-465.

[13] 曾家豫，赵静，孔维宝，等.以红三叶鲜青草预加工废水发酵培养苏云金芽孢杆菌[J].食品与发酵工业，2012，38(12)：59-63.

[14] 邹惠，张文毓，姜林，等.餐厨垃圾半固态发酵产Bt生物农药及其稳定性[J].农业工程学报，2016，32(5)：268-273.

[15] 杨航聪，金松松，黄晶晶，等.苏云金芽孢杆菌MS7培养条件的优化[J].杭州师范大学学报(自然科学版)，2013，12(6)：535-538.

[16] 孙翠霞，弓爱君，闫海，等.苏云金芽孢杆菌高浓度液体发酵培养基的优化研究[J].化学与生物工程，2006，23(9)：38-39.

[17] 孙翠霞，弓爱君，孔令芳，等.苏云金芽孢杆菌发酵技术研究进展[J].武夷科学，2006，22(1)：222-226.

[18] 常明，孙启宏，周顺桂，等.苏云金芽孢杆菌生物杀虫剂发酵生产的影响因素及其工艺选择[J].生态环境学报，2010，19(6)：1471-1477.

[19] 黄勤清，黄志鹏，关春鸿，等.苏云金芽孢杆菌WB9菌株的分离、生化特性及培养基优化[J].福建农业大学学报(自然科学版)，2006，35(4)：346-351.

[20] OZKAN M，DILEK F B，YETIS U，et al.Nutritional and cultural parameters influencing antidipteran delta-endotoxin production[J].Research in Microbiology，2003，154(1)：49-53.

Cultivation ofBacillusthuringiensiswith Food Waste Leachate

SHEN Li-jun1,DUAN Ran-ran1,ZHANG Zhi-qiang2,XU Qian-qian1,LV Le1,LIU Xiao-lu1,YIN Chun-hua1,ZHANG Hai-yang1,YAN Hai

(1.SchoolofChemistryandBiologicalEngineering,UniversityofScienceandTechnologyBeijing,Beijing100083,China;2.BeijingGreenSpaceBiotechnologyCo.，Ltd.,Beijing100097,China)

In this paper,food waste leachate was successfully used to cultureBacillusthuringiensis(Bt) and the optimum conditions for the removal of the main nutrients in the leachate were also investigated.Results showed that,with the increasing of volume fraction of food waste leachate from 25% to 100%,the growth of Bt increased,the colony forming unit of Bt reached 4.5×107CFU·mL-1after 72 h,and the removal rates of total organic carbon(TOC) and total nitrogen(TN) increased to 48.8% and 52.4%,respectively.The colony forming unit of Bt reached 1.4×108CFU·mL-1after 72 h by adding 1 g·L-1KH2PO4as a phosphorus source and 1 g·L-1MgSO4as a sulfur source in leachate.It is demonstrated that food waste leachate can be efficiently used to culture biopesticide Bt,which is an efficient way to use waste as resource with great value of application.

Bacillusthuringiensis;food waste leachate;cultivation;treatment

2017-02-22

申丽君(1992-)，女，河北邯郸人，硕士研究生，研究方向：微生物学，E-mail：m18811391351@163.com；通讯作者：闫海，教授，E-mail：haiyan@ustb.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.07.013

X172

A

1672-5425(2017)07-0061-04

申丽君，段冉冉，张志强，等.利用餐厨垃圾渗滤液培养苏云金芽孢杆菌[J].化学与生物工程，2017，34(7)：61-64.