极端沙漠干燥炎热环境土壤中耐热和耐辐射菌的分离、培养与鉴定*

张晓波陈鑫源焦 雷 刘 毅肖 霞伊法尔·艾合买江 迪丽达尔·库德热提 孙玉萍

（1新疆医科大学研究生学院 新疆乌鲁木齐 830011 2新疆医科大学临床医学院 新疆乌鲁木齐 830011 3新疆医科大学基础医学院 新疆乌鲁木齐 830011）

新疆气候类型为暖温带大陆性极干旱气候，库姆塔格沙漠位于塔里木盆地的东部，自然条件恶劣，气候极端且干旱，属于明显的极端干旱多风气候，这里白天高温、低湿，夜晚温度低，是典型的极端环境，这里必然生存着一些极端微生物种群，且尚处于未开垦阶段，因此，这将可能是发现新的具有特殊功能微生物资源的宝藏。库姆塔格沙漠地区干旱、高温、辐射程度高，不适宜生物生长，若分离得到能耐干旱高温和耐辐射的微生物，对今后研究沙漠环境微生物的生态作用，开发极端微生物资源，改善环境都具有一定的意义，同时这些耐高温、耐辐射微生物还可以应用于工业生产和医药卫生实践中。本研究目的是从库姆塔格沙漠干燥炎热极端沙漠土壤中分离培养、驯化和鉴定耐高温耐紫外线微生物，为后续耐热和辐射机制研究提供基础资料并为耐高热、耐辐射菌株的功能研究提供菌株资源储备。

1 材料和方法

1.1 样品采集和保存 实验样品为沙漠土壤样品，采集自新疆维吾尔自治区吐鲁番盆地鄯善县库木塔格沙漠（北纬 24°50′11″，东经 90°12′30″，海拔 440 m），取样深度约 10 cm，取样约 500 g，样品存放无菌瓶中，4℃保存。

1.2 培养基及试剂 LB牛肉膏蛋白胨培养基进行分离培养，LB肉汤培养基进行富集培养，均购自青岛日水生物技术有限公司。

1.3 干旱沙漠土壤耐高温耐辐射菌的驯化培养

1.3.1 确定稀释涂布的合适稀释梯度范围 将加有适量玻璃珠和90 mL生理盐水的250 mL三角瓶灭菌，称取10．0 g土壤样品于锥形瓶中，震荡制成稀释度为10-1的土壤样品悬液，从悬液中吸取1 mL于装有9 mL生理盐水的试管中，震荡均匀，得10-2的稀释液。依照此方法，制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-76 个稀释度的溶液，取 100 μL涂平板，分别紫外照射 2 min、5 min、10 min，每个稀释度做3个重复，于50℃培养箱培养。观察平板上单菌落生长情况，直至单茵落数量不再增加。确定紫外照射5 min的10-4、10-52个稀释度的单菌落生长数量情况较为理想。

1.3.2 稀释涂布平板法处理样品 样品的稀释处理步骤如 1.3.1所示，进行 10-3、10-4、10-53个稀释度稀释，将3个稀释度各做3个重复涂布，紫外灯照射5 min，于50℃ 恒温倒置培养2~3 d。观察单菌落数量变化。

1.3.3 菌株的纯化和观察 挑取稀释涂布平板上的单菌落，进行分区划线纯化，纯化3次以后，挑取平板上的单菌落进行形态学的观察（内容包括菌落颜色、形状、光泽度、潮湿度、凸起或凹陷等立体形态、是否透明、边缘是否整齐等）。利用LB培养基平板划线纯化菌株。纯化好的菌株，利用革兰氏染色，并于光学显微镜下观察菌体（染色后颜色、形态）。利用LB肉汤培养基已纯化菌株进行扩大培养后，放入4℃冰箱内保藏。

1.4 耐高温耐辐射菌基因组DNA提取及16S rDNA片段PCR扩增 用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组总DNA，并以其为模板，采用细菌通用引物 Eubac 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 Eubac 1492R （5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）对纯菌的 16S rDNA序列进行扩增［13］。 PCR 反应体系为:模板 10×PCR buffer 5 μL、dNTP（2.5 mmol/L） 4 μL、模板 2 μL、Taq DNA 聚合酶 1 μL、引物各 1 μL，补充去离子水至 50 μL。反应条件：94℃ 5 min；94℃ 50 s、55℃ 50 s、72℃ 50 s、33个循环、72℃ 7 min。PCR产物送上海生工测序，NCBI Blast（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=&LINK_LOC=blasttab）网站数据比较已知序列，鉴定已纯化菌株。

2 结果与分析

2.1 分离菌株形态学观察 高温辐射（50℃，紫外照射5 min）条件下培养共得到形态染色不同的耐高温、耐辐射的9菌株，形态描述见表1。

表1 分离培养获得耐高温耐辐射菌株的形态描述

2.2 沙漠土壤中耐高温耐辐射菌16S rDNA测序及比对 对纯化的9株菌进行16S rDNA测序并比对，共获得4株纯菌，均属于芽孢杆菌，与最相似菌株相似度高达100%，见表2。

表2 沙漠土壤中耐高温耐辐射菌16S rDNA比对结果

2.3 沙漠土壤中耐高温耐辐射菌系统发育分析 用邻接法构建系统进化树（图1）。

图1 邻接法构建的沙漠土壤中耐高温耐辐射菌16S rDNA序列系统发育树

3 讨论

极端环境是指大多数生物无法生存的，存在某些特有的物理化学条件，例如高温、低湿、高酸、高碱、高盐、高压及高辐射的环境，生活在极端环境中的微生物群体即被称为极端微生物（Extremophils）［1-2］。 极端微生物的研究因其具有重大科学意义和广泛应用价值而得到了飞速发展［3－4］。极端环境的特殊理化因素形成了特殊的微生物种类及代谢途径，这些微生物能够对抗高温、高压、高辐射等不利环境并产生特殊的生物物质［5］。耐辐射微生物具有对电离辐射、UV辐射、DNA诱变剂和干燥环境的极端抗性，在多种自然环境中都能够发现和分离耐辐射微生物，尤其在干旱及高辐射环境中发现较多［6］。例如耐辐射奇球菌（Deinococcus radioduransR1）在1956年首次由美国科学家Oregon等从辐射灭菌后变质的肉类罐头中分离出来，对电离辐射、紫外线和其他DNA损伤剂具有极强抗性，是迄今为止地球最耐辐射损伤的生物之一，其他例如 Rubrobacter、Acinetobacter、Chroococcidiopsis、Hymenobacter、Kineococcus、Kocuria、Methylobacterium和Thermococcus菌属中也有发现耐辐射细菌的报道［7］。这些耐辐射菌株除了具有UV和γ射线及许多DNA诱变剂具有一定抗性，还对干燥和过氧化物等有较强的抗性，文献报道一些耐辐射菌还具有吸附重金属离子和降解芳烃类物质的特性［8］。开发和研究这类微生物菌种资源，不仅对阐明DNA损伤修复分子机理，而且在环境保护和生物修复、人类健康，乃至地外空间的开发和利用等方面有着十分重要的意义［9－10］。

新疆维吾尔自治区吐鲁番盆地鄯善县库木塔格沙漠是典型的极端环境，干旱、高温、昼夜温差大等恶劣的环境条件并不适合大多数的微生物生长。本研究采集该地区北纬 24°50′11″，东经 90°12′30″，海拔440 m的土壤，采样地点鲜有人类活动，因此可以不考虑人为因素对样品中微生物的影响。我国其他主要沙漠的土壤微生物生物量平均数量级约为106［11-12］，本实验结果发现库姆塔格沙漠土壤微生物生物量数量级在105左右，相对其他地区微生物数量较少，分析原因可能是因为库木塔格沙漠土壤微生物的数量本来就不丰富，此外，在培养过程中，紫外线照射可能杀死了一部分微生物，因此该沙漠样品微生物生物量偏小。

本研究通过分离培养获得的细菌并经过高温和高辐射驯化获得到的耐辐射、耐高温细菌，经过序列测定发现他们分属于枯草芽胞杆菌枯草亚种（Bacillus subtilis subsp.subtilis）、地芽胞杆菌属（Geobacillussp.）、芽胞杆菌属（Bacillussp.）和热噬淀粉（Bacillus thermoamylovorans），其中优势菌属为Bacillus（91.91%），可见芽孢杆菌属是库木塔格沙漠土壤微生物群落中的优势属，2013年许璐等在对库木塔格沙漠微生物多样性的调查中也认为芽孢杆菌属是库木塔格沙漠的优势菌［13］，在其他沙漠微生物调查中，芽孢杆菌属在我国其他沙漠地区也被分离得到，如塔克拉姆干沙漠和毛乌素沙漠沙地分离出了大量芽孢杆菌属的菌株。芽孢杆菌属革兰氏阳性的大杆菌（约4~10 μm），严格需氧或兼性厌氧的有荚膜的杆菌。该属细菌的重要特性是具有较好的抗逆性，能够产生耐高温、耐干旱及抗紫外线的内生孢子，能够耐受高温、辐射、干旱，使其能更好地适应沙漠环境，在自然界中分布广泛。

4 结论

本研究结果进一步证实了芽孢杆菌属是新疆干旱沙漠土壤环境中的优势菌群；驯化获得5种耐热和耐辐射菌，不仅在今后沙漠环境微生物的研究中具有一定的参考意义，并为今后对其功能研究储备菌种和微生物资源。此次分离菌株种类较为单一且数量较少，可能原因为：1）沙漠环境较为极端，微生物分布的种类和数量本身较少；2）本实验所使用培养方法针对性不高，无法完全培养沙漠环境全部微生物。