食品中常见乳酸菌高效降解发酵性能评价

2017-07-31迟雪梅张庆芳

食品与发酵工业 2017年6期

迟雪梅，张庆芳*

1(大连大学生命科学与技术学院，辽宁大连，116622)2(辽宁省海洋微生物工程技术研究中心，辽宁大连，116622)

迟雪梅1,2，张庆芳1,2*

1(大连大学生命科学与技术学院，辽宁大连，116622)2(辽宁省海洋微生物工程技术研究中心，辽宁大连，116622)

通过接种亚硝酸盐(NO2-)纯培养液及发酵蔬菜，对Streptococcuslastic，Lactobacillusleicmannii，Lactobacillusbrevis等9种食品常见乳酸菌种进行NO2-降解实验，并从NiR降解阶段和H+降解阶段去分析评价该菌降解NO2-的能力。分析认为,Lactobacilluscaseisubsp.rhamnosusmutation，Lactobacillusbrevis具有高效降解NO2-能力，其中Lactobacilluscaseisubsp.rhamnosusmutation在NiR降解阶段降解NO2-能力强，但由于该菌产酸能力较强，使其迅速进入H+降解阶段，而使NO2-降解速度变得缓慢；而Lactobacillusbrevis一直能够处于NiR降解NO2-阶段，能使该菌所处环境中NO2-被迅速分解。分析认为，由于该菌产酸为异型发酵途径，产酸量较低，且Lactobacillusbrevis产生的NiR为同步合成型，能快速产生NiR，该菌产生的H+中和其降解NO2-生成的碱性物质，使发酵环境一直处于NiR最适作用pH值(5.0 ～ 6.0)，从而使NO2-被快速降解。

乳酸菌；NO2-降解；性能评价

随着经济的发展，工业生产中形成的氮氧化物(NOx)的排放量及农业生产中氮肥的使用量急剧增加，这些氮源导致环境中NO3-和NO2-的含量显著上升[1]，导致蔬菜中含有大量NO3-。蔬菜腌渍发酵过程中，NO3-可被大肠杆菌等细菌还原成NO2-，其反应过程是不可避免的[2]。

研究表明，NO2-能与蛋白质代谢物反应生成强致癌物亚硝胺和亚硝酸钠，后者可通过促进细胞分泌TGF-β1和IL-8，诱导人肝癌细胞SMMC-7721上皮-间质转化，使癌细胞增殖[3]。此外，饮食摄入过多的NO2-会显著提高膀胱癌、大肠癌的患病率[4-6]。

研究发现乳酸菌具有降解NO2-的作用。乳酸菌对NO2-的降解分为酶降解和酸降解2个阶段[7]。在发酵的前期，培养液pH值> 4.5时，乳酸菌对NO2-降解以NiR降解为主；发酵后期，由于乳酸菌本身产生酸，使培养液pH值降低，当pH值< 4.0后，NO2-的降解主要以酸降解为主。乳酸菌发酵是自然发酵过程中的主要发酵过程，在食品中应用广泛，如Streptococcuslastic、Lactobacillusleichmannii、Lactobacilluscasei、Streptococcusthermophilus、Streptococcuscremoris等应用在制作乳饮料、发酵酸奶及酸乳豆产品中[8-11]；Lactobacillusplantarun、Lactobacillusbrevis、Lactobacilluscaseisubsp.rhamnosus等应用于奶油、肉类及蔬菜发酵产品中[12-13]。

本课题组同时采用Streptococcuslastic、Lactobacillusleichmannii、Lactobacilluscasei、Streptococcusthermophilus、Streptococcuscremoris、Lactobacillusplantarun、Lactobacilluscaseisubsp.rhamnosus、Lactobacillusbrevis、Lactobacilluscaseisubsp.rhamnosusmutation等9种食品中常见乳酸菌进行降解NO2-研究，并从NiR降解阶段和H+降解阶段去分析评价高效降解NO2-乳酸菌的发酵性能。

1 材料与方法

1.1 试验菌种

Streptococcuslastic(Sl)；Lactobacillusleichmannii(Ll)；Lactobacillusbrevis(Lb)；Lactobacillusplantarun(Lp)；Streptococcuscremoris(Sc)；Lactobacilluscasei(Lc)；Streptococcusthermophilus(St)；Lactobacilluscaseisubsprhamnosus(Lk)；Lactobacilluscaseisubsprhamnosusmutation(Ln)，以上菌株为本研究室保藏。

1.2 蔬菜原料

学校附近农贸市场购买。

1.3 培养基及培养液配方

MRS固体培养基[14]。

液体培养基：不加琼脂，其他成分同MRS固体培养基。

1.3.3 含NO2-的液体培养基

液体培养基中添加入50、100、125、150及250 mg/L的NO2-。

1.4 菌种活化

菌种活化培养基为MRS液体培养基。

一次活化：取纯化后穿刺保藏的各菌种试管，分别穿刺3针接于10 mL液体培养基试管中，重复3次，30 ℃培养48 h。

二次活化：取一次活化各菌种菌液，按10%接种量接种于液体培养基扩大培养，30 ℃培养48 h。

1.5 试剂与仪器

HD-1360超净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司；THZ-312台式恒温振荡，上海精宏实验设备有限公司；280 型轻便手提压力蒸气消毒器，沈阳市医疗器械二厂；BZ-01显微镜，德国徕卡；UV-120-02紫外可见分光光度计，上海尤尼科科技仪器有限公司；pHB-4p 酸度计，美国哈希HACH公司。

1.6 方法

1.6.1 蔬菜发酵工艺流程

甘兰→清洗→烫漂→沥水→切段→装瓶→压石→注盐水→接种→密封→发酵

1.6.2 蔬菜发酵技术要点

把清洗过的甘兰叶片放在恒温水浴锅中，水温85～90 ℃，烫0.5～1 min，取出后迅速投入冷水中漂洗；把漂洗后的甘兰放在筛筐中沥去表面水分；甘兰叶片切段3～4 cm；切段后的甘兰分别装入灭菌的玻璃瓶(500 mL)中，每瓶装量250 g，并按实；在装紧甘兰的瓶中放一块无菌石块，重约80～100 g，配制2%的盐水溶液，煮沸过滤，晾凉，每瓶注入325 mL；将已培养36 h、OD620值相一致的9种乳酸菌液，各取10 mL，分别加入9个玻璃瓶中，菌液摇匀；无菌瓶盖密封；于25～30 ℃保温发酵。

1.7 测定指标及方法

OD620值：吸光度法。

活菌数：平板菌落计数法。

总酸：酸碱滴定。

pH值：酸度计法。

NO2-：盐酸萘乙二胺法。

标准曲线的绘制：从装置5 μg/mL亚硝酸钠溶液的容量瓶中分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mL于6支25.0 mL的比色管中，加入2.0 mL对氨基苯磺酸溶液，混匀，避光静置5 min，再加入1.0 mL盐酸萘乙二胺溶液，加蒸馏水定容至25.0 mL，混匀，避光静置15 min后，于波长538 nm处测吸光度值并记录。得标准曲线回归方程为：y= 0.138 74x+ 0.001 41，R2= 0.99 9。

样品测定[15]：发酵菜10 g，研磨成匀浆(汤汁10 mL，或含NO2-培养液2 mL)→用150 mL水转移至250 mL容量瓶中→加6 mL饱和硼酸钠→用0.1 moL/L NaOH调至pH9→65℃温度下恒温水浴10 min→冷却→定容静置30 min→过滤→取滤液40 mL→显色→加蒸馏水定容至50 mL→混匀→于波长538 nm处测吸光度值→计算NO2-。同时以等量蒸馏水作空白对照。

NH3：奈斯勒试剂法。

NO3-：镉柱还原法[16-17]。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌发酵特性的研究

将二次活化后Sl、Ll、Lc等9种乳酸菌液，按等量菌数接入pH7.2的液体MRS培养基中，30 ℃恒温培养，定时测定培养液总酸，结果见图1。

图1 乳酸菌不同时间产酸量变化Fig.1 The change of lactic acid bacteria produce acid in different time

如图1可知，Ln、Lp、Lc产酸量明显高于其他6种乳酸菌；Lb、Ll、Lk 稍高于Sl、Sc、St产酸量。

2.2 乳酸菌降解NO2-的研究

2.2.1 乳酸菌降解培养液NO2-含量变化

在含有NO2-(初始浓度为125 mg/L)的MRS液体培养基中，分别接入等量菌数不同乳酸菌种，于30 ℃恒温培养，定时测定发酵液中NO2-的含量，结果见图2。

图2 发酵液中NO2-的含量Fig.2 Content of NO2- in the fermentation broth

从图2、图3、图4可以明显看出，含有NO2-的培养液中接入的9种乳酸菌都能降解NO2-，其中Ln菌种在12 h内降解NO2-能力显著高于其他菌种，降解率高达60%，在24 h后降解NO2-变得较缓慢，60 h接种Ln的培养液仍有NO2-残留；Lb菌种在12 h内降解NO2-能力仅次于Ln，12 h后Lb菌种发酵的培养液NO2-快速被降解，在48 h 时NO2-被全部降解。分别对12h和24 h 9种乳酸菌降解NO2-的降解量进行差异显著性分析，结果表明12 h，Ln菌种降解NO2-能力显著高于其他菌种；24 h，Lb菌种降解NO2-能力显著高于其他菌种。

图3 12 h发酵液中NO2-的残留量Fig.3 Residual amount of NO2- in the fermentation broth at 12 h

图4 24 h发酵液中NO2-的残留量Fig.4 Residual amount of NO2- in the fermentation broth at 24 h

2.2.2 乳酸菌发酵菜汁中NO2-含量变化

分别接种9种乳酸菌，进行蔬菜发酵，定时测定发酵液中NO2-的含量，结果见图5。

图5 发酵菜汁中NO2-的含量Fig.5 The content of NO2- in fermented vegetables juice

由图5可知，接入乳酸菌种不同，汤汁中NO2-变化曲线也不同；亚硝峰出现时间基本相同，但峰值不同。其中接种Lb，St的菌种的发酵菜在整个发酵过程中汤汁中都检测不出NO2-，Sc发酵96 h汤汁中检测不出NO2-，Sl、Ln发酵120 h汤汁中检测不出NO2-。

蔬菜原料中含有大量的NO3-，发酵初期菜中含有能产生NiR的菌大部分为好氧菌，能使NO3-还原为NO2-，随着时间的延长，NO2-的积累逐渐增多；而在水下(兼厌氧环境中)乳酸菌开始活动、大量繁殖，产生NiR和酸，从而导致NO2-被降解，也是“亚硝峰”出现的原因[18-19]。接种发酵能使乳酸菌快速成为优势菌群，NO2-快速被降解，从而使“亚硝峰”的峰值降低；菌种不同，产生NiR及H+的量不同，对“亚硝峰”的峰值大小都会有影响[7-8,20]，如图5所示。

2.2.3 乳酸菌降解NO2-的pH值变化

对以上3种情况(无NO2-培养液，含NO2-培养液，发酵菜汤汁)的pH值变化进行分析，如图6～图8。

图6 无NO2-发酵液pH值的变化Fig.6 The change of pH in fermentation broth without NO2-

图7 含NO2-发酵液pH值的变化Fig.7 The change of pH in fermentation broth with NO2-

图8 发酵菜汤汁pH值的变化Fig.8 The change of pH in fermented vegetables juice

由图6、图7比较可知，同一菌种接种发酵，含NO2-培养液的pH值都高于不含NO2-培养液的pH值；由图7可知，Lb接种发酵过程中，其环境pH值显著高于其他菌种发酵的环境pH值，pH值一直处于5.5～6.5之间；由图8可知，接种Lb的发酵菜汤汁pH值明显高于接种其他菌种发酵菜汤汁的pH值，且pH值在5.0～6.0之间。

实验中还发现Lactobacillusbrevis无论接种在含有NO2-的培养液中还是在发酵菜中，检测有NH3的生成。

张庆芳[7]等人认为乳酸菌对NO2-的降解分为酶降解和酸降解2个阶段。在发酵的前期，培养液pH值> 4.5时，乳酸菌对NO2-降解以NiR降解为主；发酵后期，由于乳酸菌本身产生酸，使培养液pH值降低，当pH值< 4.0后，NO2-的降解主要以H+降解为主。张庆芳[21]等在相同pH值下，用接种乳酸菌的培养液中NO2-降解量减去未接种乳酸菌中NO2-的降解量，排除了H+对NO2-降解的影响。证明Lactobacillusbrevis产生的NO2-还原酶降解NO2-的最适pH值在5.0 ～ 6.0之间。龚钢明[8]等人2011年将细胞破碎、通过硫酸铵盐析方法从Lb(Lactobacillusbrevis)中提取NiR，其中NiR最适pH 值为pH5.5，酶的Km值为120.5 μg/mL。

2.2.4Lactobacillusbrevis降解NO2-能力的分析

为进一步探明乳酸菌降解NO2-的能力，分别对含有NO2-浓度为0、50、100 和250 mg/L的培养液接种Lactobacillusbrevis，定时检测培养液中菌数、总酸、pH值和NO2-含量，如图9、图10所示。

1-100 mg/L的降解率；2-lg N;3-0 mg/L总酸；4-50 mg/L总酸；5-100 mg/L总酸；6-200 mg/L总酸图9 菌数、NO2-降解率、总酸的变化曲线Fig.9 The change of the number of bacteria NO2- and total acid

如图9所示，Lb菌种0～2 h为迟缓期，2～24 h为对数期，24～48 h为稳定期，48 h后进入衰亡期。在8～36 h(菌生长的对数期及最大期的前期)不含NO2-的乳酸菌培养液中，酸积累曲线变化幅度非常大，酸大量增加；而含NO2-的乳酸菌培养液在同一时期(NO2-大量降解阶段)，酸的积累非常缓慢。36 h以后，不含NO2-的菌液酸变化不大，曲线变化平缓；而含NO2-的菌液在36h以后(NO2-全部被降解)，酸才开始积累，48 h后快速上升。96 h以后所有菌液酸的积累都接近一致。

通过图7、图9可看出，在菌的对数期，接有Lb的NO2-培养液，其NO2-降解一直处于NiR降解阶段[7-8]。进而对Lb菌种进行产酶类型分析，见图10。

1-lgN;2-50 mg/L;3-100 mg/L;4-250 mg/L图10 NO2- 培养液中菌数、NO2-降解率曲线比较Fig.10 Comparison of the number of bacteria and NO2- degradation rate

由图10可知，纵坐标与横坐标的比，即曲线的斜率，也是NO2-降解量与时间的比，即为NiR的催化反应速度。而“在底物浓度足够高的情况下，酶催化反应速度与酶浓度成正比”[22]。由图10还可看出在4～36 h ，4条曲线的斜率大小一致，即NO2-降解率曲线与菌生长曲线弹性相同，说明该乳酸菌合成的NiR速度与细胞生长速度紧密联系。由此可推导Lactobacillusbrevis产生的NiR类型为同步合成型[22]。说明Lactobacillusbrevis在生长的对数期产生大量NiR。

3 讨论与结论

3.1 讨论

张庆芳[7]等人认为乳酸菌对NO2-的降解分为酶降解和酸降解2个阶段。在发酵的前期，培养液pH值>4.5时，乳酸菌对NO2-降解以NiR降解为主；发酵后期，由于乳酸菌本身产生酸，使培养液pH值降低，当pH<4.0后，NO2-的降解主要以H+降解为主。张庆芳[20]等人用接种乳酸菌的培养液中NO2-降解量减去不接种的同一pH值下NO2-的降解量，排除了H+对NO2-降解的影响。证明Lb产生的NiR降解NO2-的最适pH在pH5.0～6.0之间。龚钢明[8]等人将细胞破碎、通过硫酸铵盐析方法从Lb(短乳杆菌)中提取NiR，其NiR最适pH 5.5，酶的Km值为120.5 μg/mL。进一步对Lb产生的NiR类型进行分析见图10，Lb菌种产生的NiR类型为同步合成型。该类型菌种合成酶速度与细胞生长速度紧密联系，当细胞进入对数生长期，酶大量生成；当细胞生长进入稳定期后，酶的合成随即停止[22]。我国学者卢海强[23]等人认为NO2-还原酶为诱导酶，诱导酶也是按此模式进行生物合成。

由图9可知，不含NO2-的乳酸菌培养液中，在菌的生长对数期酸快速积累；在同一生长时期，含NO2-的乳酸菌培养液酸积累非常的缓慢。研究发现NO2-在NiR的作用下可产生NH4+[24-27]。另外，无论在含有NO2-的发酵培养液中还是在发酵菜的汤汁中，检测有NH3的生成。因此，比较图7和图6可看出，乳酸菌产生的NiR降解NO2-生成的碱性物质使发酵环境的pH值回升。

在食品中常见乳酸菌高效降解NO2-发酵性能评价研究中，用9种乳酸菌接种的含NO2-的培养液，在发酵12 h时，菌的pH都在pH5.0～6.5之间，其中Ln降解NO2-显著高于其他菌种，且降解率高达60%，在24 h后降解NO2-变得较缓慢，60 h Ln接种的培养液仍有NO2-残留。由图1可知，Ln产酸量高；由图6～图8可知，24 h Ln无论接种在纯培养中还是接种发酵菜，其pH值都小于4.0，此时Ln降解NO2-进入H+降解NO2-阶段[20]。本研究还将Ln接种在用缓冲液配置的pH值分别为pH3.5、pH4.5、pH5.5的含NO2-的培养液中，12 h检测NO2-残留量，见表1。由表1可以看出，该菌种对NO2-降解能力酶降解阶段大于H+降解阶段。

表1 不同pH值下接种发酵液中NO2-残留量

本次实验研究还表明，在发酵中后期，Lb无论是接种在含NO2-的培养液中还是接种发酵菜的汤汁中，其pH值一直处于pH5.0～6.0之间，说明Lb降解NO2-一直处于NiR作用时期[7,8]。从而使得接有Lb菌种的NO2-培养液，NO2-大量降解且48h后NO2-无残留；接种在发酵菜(经烫漂后菜中NO3-含量为895.23 mg/kg)中，在发酵期间汤汁中检测不出NO2-，菜中也无NO2-残留。

3.2 结论

对Streptococcuslastic，Lactobacillusleicmannii，Lactobacillusbrevis等9种食品常见乳酸菌种进行NO2-降解研究，分析认为Lactobacilluscaseisubsp.rhamnosusmutation，Lactobacillusbrevis具有高效降解NO2-能力。Lactobacilluscaseisubsp.rhamnosusmutation在NiR降解阶段降解NO2-能力强，但由于该菌产酸能力较强，使其迅速进入H+降解阶段，而使NO2-降解速度变的缓慢。Lactobacillusbrevis一直能够处于NiR降解NO2-阶段，能使该菌所处环境中NO2-迅速被彻底分解。分析认为：由于该菌产酸为异型发酵途径，产酸量较低，且Lactobacillusbrevis产生的NiR为同步合成型，能快速产生NiR，从而使该菌产生H+中和了NiR降解NO2-生成的碱性物质，使发酵环境一直处于NiR最适作用pH值(5.0 ～ 6.0)，从而使NO2-快速被降解。

4 展望

由于NiR的最适作用pH值为pH5.0 ～ 6.0，因此食品级的NiR粗酶液可以作为中性或偏酸性食品的添加剂来去除食品中的NO2-，以提高食品的安全性；精致纯化的NiR液可应用于临床NO2-中毒患者体内NO2-的清除，以达到解毒的功效；如NO2-作为防腐剂或发色剂来腌制红肉制品，在食用之前(灭菌之前)可直接加入类似Lactobacillusbrevis的食用乳酸菌液，来清理残留的NO2-；亦可以采用复合菌剂进行发酵食品生产，如发酵初期可接种类似Lactobacillusbrevis的乳酸菌，使其NO2-大量被降解，发酵一定时间以后，再接种产酸高、风味好的其他食用乳酸菌进行发酵，这样的高酸发酵食品，既风味好又无或少NO2-残留。

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CHI Xue-mei1,2,ZHANG Qing-fang1,2*

1(College of Life Science and Technology, Dalian University, Dalian 116622, China)2(Liaoning Marine Micr-obial Engineering and Technology Center, Dalian 116622, China)