液基薄层细胞涂片在胸腹水诊断中的应用价值

禹 乐， 孟加榕， 朱启淦， 杨立民， 温路生， 魁国菊， 潘羡心

(解放军第175医院，厦门大学附属东南医院病理科，漳州 363000； *通讯作者，E-mail：mengjiarong@sina.com)

液基薄层细胞涂片在胸腹水诊断中的应用价值

禹 乐， 孟加榕*， 朱启淦， 杨立民， 温路生， 魁国菊， 潘羡心

(解放军第175医院，厦门大学附属东南医院病理科，漳州 363000；*通讯作者，E-mail：mengjiarong@sina.com)

目的 探讨液基薄层细胞涂片法在胸腹水诊断中的应用价值。 方法 选取临床科室送检的可疑阳性胸腹水107例，分别采用液基薄层细胞涂片法和传统细胞涂片法制片，必要时分别行免疫细胞化学染色，比较两种方法的涂片质量及恶性肿瘤的确诊率。 结果 应用液基薄层细胞涂片技术获得的细胞涂片及免疫细胞化学染色效果均优于传统涂片法，统计结果显示液基薄层细胞涂片法的恶性肿瘤确诊率为30.8%，高于传统细胞涂片法的11.2%，两组确诊率差异有统计学意义(P<0.05)。 结论 液基薄层细胞涂片法在胸腹水诊断中可以提高恶性肿瘤确诊率，且涂片质量、染色效果均优于常规涂片法。

胸水； 腹水； 细胞学； 免疫细胞化学染色

胸腹水是常见的临床体征，病因非常复杂，其良恶性的鉴别也是临床上的难点，恶性胸腹水常见于原发性或转移性肿瘤，胸腹水的良恶性鉴别诊断对临床医生在治疗上有重要的指导意义[1]。由于传统的胸腹水制片方法易受到胸腹水的新鲜程度、细胞数量、退变程度、血细胞含量多少、固定状态以及染色情况等因素的影响，给病理诊断带来较大的困扰，特别是对于高度增生的间皮细胞、良恶性间皮瘤细胞以及转移性腺癌细胞的鉴别诊断更为困难[2]，因此经常需要借助免疫细胞化学染色加以辅助鉴别诊断，现行基于传统细胞涂片上的免疫细胞化学染色效果总是不能令人满意。为了提高胸腹水脱落细胞学检测恶性肿瘤的确诊率并改善脱落细胞学涂片及免疫细胞化学染色的质量，笔者对胸腹水细胞涂片的方法和免疫细胞化学染色实验条件进行研究，经过长期实验摸索出一种简便、可靠的方法，现介绍如下。

1 材料和方法

1.1 材料

收集2015-01～2016-05中国人民解放军第175医院临床科室送检的可疑阳性胸腹水标本107例，男65例，女42例。

1.2 试剂

液基细胞涂片试剂盒来自孝感泰康达医疗设备有限公司，用于免疫组织化学染色试剂均来自福州迈新公司，酸性亚硫酸钠、蛋白酶K浓缩剂来自厦门艾德生物医药科技股份有限公司。

1.3 液基薄层细胞涂法

取新鲜胸腹水10 ml于试管中，2 000 r/min离心4 min，去上清液。加入液基细胞保存液5 ml于试管中，震荡均匀后放置10 min，2 000 r/min离心4 min，去上清液，按沉淀体积约50倍的比例加入液基细胞固定液，震荡均匀后，取1 ml细胞悬浊液加入制片模具中，1 400 r/min离心4 min，取出涂片，待晾干后HE染色。

1.4 传统细胞学涂片法

胸腹水充分震荡后，取10 ml于试管中以2 000 r/min离心4 min，将沉淀物直接涂片，95%乙醇固定后HE染色。

1.5 免疫细胞化学染色

两种细胞涂片分别置于pH为6.0的柠檬酸溶液中高压热修复5 min，自然冷却后置于3%H2O2中10 min，PBS洗涤3次，每次间隔3 min；10%的酸性亚硫酸钠处理15 min，PBS洗涤3次，每次间隔3 min；涂片置于1%的蛋白酶K溶液中，37 ℃孵育9 min，PBS洗涤3次，每次间隔3 min。依据需要诊断需要选择标记抗体，滴加后37 ℃孵育1 h，PBS洗涤3次，每次间隔3 min。滴加酶标二抗，室温放置15 min，PBS洗涤3次，每次间隔3 min，DAB显色液，苏木素复染，中性树胶封固。

1.6 诊断标准

由两位经验丰富的细胞病理学诊断医生同时阅片，诊断采用三种分类方法，分别为阴性、可疑肿瘤细胞和确诊恶性肿瘤细胞，其中恶性肿瘤细胞的确诊需免疫细胞化学染色进一步确认。

1.7 统计学方法

应用SPSS 13.0统计分析软件进行数据处理，两个率的比较选择χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色结果

传统细胞涂片：胸腹水细胞涂片中的细胞薄厚不均匀、细胞成堆分布重叠较为严重，细胞收缩变性较为常见，结构不清，染色晦暗，核浆对比不清晰，有大量红细胞、炎性渗出物及黏液混杂在一起，造成背景不清晰(见图1)。

液基薄层细胞涂片：胸腹水细胞涂片中的细胞结构完整，分布均匀，细胞无收缩，染色鲜艳，核浆对比清晰，很少有红细胞干扰，背景清晰(见图2)。

图1 胸腹水的传统细胞涂片 (HE染色)Figure 1 Traditional cytology of pleural and ascitic fluid by HE

图2 胸腹水的液基薄层细胞涂片 (HE染色)Figure 2 Thinprep cytologic smear of pleural and ascitic fluid by HE

2.2 免疫细胞化学染色结果

基于传统细胞涂片的免疫细胞化学染色:涂片的细胞成堆分布重叠较为严重，染色效果深浅不一，背景不够清晰，常常因大量的红细胞、炎性渗出物及黏液作用而呈现出淡褐色，严重影响阳性结果的判读。阳性信号定位不准确，细胞膜、细胞浆、细胞核表达的抗体，均有定位于细胞浆中的错觉，无法进行准确判别(见图3)。

基于液基薄层细胞涂片的免疫细胞化学染色:涂片中的细胞分布均匀，密度高，红细胞带来的非特异性着色较少，背景清晰，染色定位准确。CK7抗体较准确地定位于细胞质(见图4A)；Ki-67抗体较准确地定位于细胞核(见图4B)；CD79a抗体比较准确地定位于细胞膜(见图4C)。

图3 基于传统细胞涂片上的免疫细胞化学染色(DAB显色)Figure 3 Immunocytochemical staining of tumor cells based on conventional cell smears (DAB staining)

图4 基于液基薄层细胞涂片上的免疫细胞化学染色(DAB显色)Figure 4 Immunocytochemical staining of tumor cells based on liquid-based thin-layer cell smears (DAB)

2.3 不同方法检测结果比较

统计107例胸腹水样本的细胞学诊断结果，应用传统普通细胞涂片法确诊为恶性肿瘤的12例(11.2%)，可疑阳性为16例(15.0%)，阴性的为79例；液基薄层涂片法确诊恶性肿瘤为33例(30.8%)，可疑阳性为2例(1.9%)。液基薄层涂片的恶性肿瘤确诊率高于传统普通涂片，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

3 讨论

表1 胸腹水样本不同方法检测结果比较 (例)

Table 1 Comparison of diagnostic rate between different methods (cases)

方法n阳性可疑阳性阴性阳性确诊率(%)传统细胞学涂片法10712167911．2液基薄层细胞涂片法1073327230．8∗

与传统细胞学涂片法比较，*P<0.01

胸腹水是一种比较容易得到的标本，标本采集创伤小、操作简单[3]。胸腹水检测多采用直接涂片法，方法简便、快速，在临床上应用比较广泛。但应用这种传统的方法制作出来的细胞涂片常常会出现大量红细胞、炎性渗出物及黏液混杂在一起，造成背景不清晰；同时易受到人为因素的影响而出现细胞薄厚不均匀、细胞多层重叠较为严重、有些阳性细胞甚至被干扰物所覆盖、细胞结构不清等情况，增加了阅片难度，给病理诊断带来很大的影响[4]。液基薄层细胞技术现在主要用于女性宫颈癌筛查，与传统脱落细胞学直接涂片法比较，具有薄层、背景清晰、面积小、血液成分少、利于显微镜观察等优点，随着该技术的不断完善，目前已开始尝试应用于其他非妇科标本的制备。应用液基薄层细胞技术制作胸腹水细胞涂片的方法简单、快捷，其重复性也比较满意，收集一次胸腹水标本, 可以制出多张类似的超薄涂片[5]。液基试剂盒中所用的固定液含有去除红细胞成分，应用这种固定液固定后，所制作的胸腹水涂片中红细胞和红细胞碎片较少，其他种类的细胞固定充分，应用苏木素伊红染色后，细胞的结构完整，染色鲜艳，核浆对比清晰，细胞无收缩，无红细胞干扰，背景清晰。液基固定液能够较好地保留细胞抗原成分，为需要应用免疫细胞化学染色进行鉴别诊断的病例提供了条件。

免疫细胞化学染色技术的特色是把结构和功能结合起来，有效地分析细胞的化学成分，其敏感性和特异性较高[6]。以往也有很多人对细胞免疫细胞化学染色技术进行探讨，结果都不是令人特别满意，主要问题是阳性信号定位不够准确，特别是阳性信号定位于细胞核的抗体效果最不理想。我们经过研究发现，细胞涂片中的细胞经过固定后犹如一个荷包蛋，细胞核的表层有较完整的细胞膜覆盖，所以细胞膜表达的抗体会在细胞核所在的位置上着色。由于细胞膜的存在，使抗体不容易透过细胞膜与细胞核中的抗原成分充分接触，从而导致定位于细胞核的抗体阳性表达太弱，效果不能令人满意。笔者进行多次试验和摸索，应用酸性亚硫酸钠和热力学作用对细胞膜进行处理，可以增加细胞膜的通透性，再利用1%的蛋白酶K在37 ℃的条件下消化9 min，这样刚好可以去除覆盖在细胞核上的一层细胞膜与细胞质，同时又不影响细胞周边的细胞膜应有的表达。应用上述这种方法对胸腹水的液基薄层涂片进行免疫细胞化学染色，取得了很好的效果，背景干净，阳性信号定位准确，为临床病理诊断提供了可靠的技术手段。

液基薄层涂片制作简单，快捷，特别适用于胸腹水中细胞量较少而无法进行制作细胞块的病例[7]。临床上有很多不适于手术和活检的肿瘤患者，可以应用这种方法制作液基薄层涂片，还可以对涂片上的脱落细胞进行免疫细胞化学染色标记，以明确其肿瘤的性质、类型以及原发灶，从而指导临床对患者进行放、化疗。液基薄层涂片在胸腹水中的应用可以解决过去细胞学上存在的诸多难题，能够大大地提高胸腹水脱落细胞学检测的阳性率，从而具有很大的推广和应用前景。

[1] 陶伟,李俊.细胞DNA定量分析在鉴别良恶性胸腹水中的应用价值[J].安徽医科大学学报,2015,50(7):1016-1019.

[2] Bisht B,Handa U,Mohan H,etal.Complementary value of DNA flow cytometry and image morphometry in detection of malignant cells in effusion fluids[J].Malays J Pathol,2014,36(2):83-90.

[3] 杨倩.脱落细胞学检查、DNA倍体分析与血清肿瘤标志物联合检测诊断恶性胸腹水的价值[J].蚌埠医学院学报,2015,40(8):1064-1048.

[4] 肖同浩,陈寿松,熊丽萍,等.提高胸腹水肿瘤细胞检出率的方法探讨[J].临床军医杂志,2009,37(2):277-278.

[5] 张培谊,邹赛英,王玉兰,等.TCT技术在胸腹水恶性肿瘤诊断中应用[J].临床与实验病理学杂志,2005,20(3):357-358.

[6] 曹跃华,杨敏,陈隆文,等.细胞病理学诊断图谱及实验技术[M].北京:北京科学技术出版社,2009:433.

[7] 吴秉铨,刘彦仿.免疫组织化学病理诊断[M].北京:北京科学技术出版社,2007:87.

Application value of liquid-based cytology smear in diagnosis of pleural effusion and ascites

YU Le, MENG Jiarong*, ZHU Qigan, YANG Limin, WEN Lusheng, KUI Guoju, PAN Xianxin

(DepartmentofPathology, 175thHospitalofPLA,DongnanAffiliatedHospitalofXiamenUniversity,Zhangzhou363000,China;*Correspondingauthor,E-mail:mengjiarong@sina.com)

ObjectiveTo explore the value of thinprep cytologic test in the diagnosis of hydrothorax and ascites.MethodsTotally 107 samples of suspected positive pleural effusion ascites were selected and analyzed by the liquid based thin-layer cell smear and conventional cell smears, respectively. If necessary, immunocytochemical staining was used. The smear quality and the diagnostic rate of malignant tumors were compared between the two methods.ResultsThe results of cell smears and immunocytochemical staining were better than that of traditional smears. The diagnostic rate of malignant tumor was 30.8% by ThinPrep cytology, which was higher than that of the traditional cell smear method(11.2%，P<0.05).ConclusionThinprep cytology test can improve the diagnosis rate of malignant tumor in pleural effusion and ascites, with better smear quality and staining effect than conventional smear method.

hydrothorax; ascites; cytology; immunocytochemistry

禹乐，男， 1984-07生，在读硕士，主管技师，E-mail：422245066@qq.com

2016-07-08

R446

A

1007-6611(2017)02-0149-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.02.012