青蒿素通过抑制JAK2/STAT3信号通路诱导肝癌细胞凋亡

郭佳培， 郭 彬， 李雷雷， 刘殿星， 石 峻， 吴景华

(华北理工大学附属医院检验科，唐山 063000; *通讯作者,E-mail：tswujinghua@163.com)

青蒿素通过抑制JAK2/STAT3信号通路诱导肝癌细胞凋亡

郭佳培， 郭 彬， 李雷雷， 刘殿星， 石 峻， 吴景华*

(华北理工大学附属医院检验科，唐山 063000;*通讯作者,E-mail：tswujinghua@163.com)

目的 研究青蒿素对肝癌细胞中JAK2/STAT3信号通路活化的影响，探讨青蒿素抗肿瘤的相关机制。 方法 选择15只6-8周龄的C57BL/6J小鼠，采用二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DEN)腹腔注射和CCl4灌胃方法构建小鼠肝癌模型，随机分为PBS组、青蒿素组和青蒿素+pJAK2多肽组，另选5只正常小鼠作为空白组。PBS组和青蒿素组分别腹腔注射PBS及青蒿素(100 mg/kg)，隔日作用，3周后处死小鼠；青蒿素+pJAK2多肽组应用pJAK2多肽[100 μmol/(L·kg)]隔日作用3次后，再联合青蒿素隔日作用3周，处死小鼠；分离肿瘤组织，Western blot检测肿瘤组织Caspase 3的表达，免疫荧光检测组织中p-JAK2及p-STAT3的表达。 结果 成功构建小鼠肝癌模型，荷瘤小鼠经青蒿素作用后肿瘤组织Caspase 3蛋白表达显著增加(P<0.001)。同时免疫荧光结果显示青蒿素组肿瘤组织中的p-JAK2及p-STAT3磷酸化水平较之PBS组明显降低；荷瘤小鼠经pJAK2多肽预处理后，青蒿素诱导荷瘤小鼠表达Caspase 3显著降低(P<0.05)，差异有统计学意义。 结论 青蒿素通过抑制JAK2/STAT3信号通路活化诱导肝癌细胞凋亡，进而发挥抗肿瘤作用。

肝癌； 青蒿素； JAK2/STAT3； 细胞凋亡

肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常见恶性肿瘤之一，其发病率逐年增高，病死率在肿瘤中位居第二[1]。由于其起病隐匿和进展迅速等特点，多数患者确诊时已是中晚期。因此，化疗成为常用的治疗手段。然而细胞毒性药物化疗效果往往不理想，并且对正常细胞也有一定的毒副作用[2]，因此中晚期肝癌的治疗方式仍有待进一步拓展与改善。青蒿素是1971年由中国首次从黄花蒿叶中提取的倍半萜内酯类化合物，因其抗疟性强、毒性低，为治疗疟疾的首选药物。目前有研究表明，青蒿素具有抗肿瘤细胞活性和抑制肿瘤的作用，可以诱导肝癌细胞凋亡[3]，本实验对青蒿素抗肿瘤作用进行深入观察与分析，探究青蒿素诱导肝癌凋亡的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

青蒿素注射液(广州汉方现代中药研究有限公司，批号100651)，anti-p-JAK2抗体(美国，CST)，anti-p-STAT3抗体(美国，CST)，anti-Caspase 3抗体(美国，CST)，p-JAK2多肽(上海，吉尔生化)，FITC-anti-IgG(中国，碧云天)，TRITC-anti-IgG(中国，碧云天)，蛋白电泳仪(Bio-rad，美国)，Image Lab凝胶成像分析系统(Bio-rad，美国)，免疫荧光显微镜(日本，奥林巴斯)。

1.2 小鼠肝癌模型构建

选择SPF级C57BL/6J小鼠20只(华北理工大学实验动物中心SPF级环境饲养，生产许可证号：SCXK(军) 2014-0001)，6-8周龄，体质量23-28 g。随机分为空白组、PBS组、青蒿素组、青蒿素+pJAK2多肽组，每组5只。其中PBS组、青蒿素组、青蒿素+pJAK2多肽组小鼠构建肝癌模型。三组小鼠在适宜的相同环境中饲养6 d，小鼠腹腔注射100 mg/kg的二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DEN)，小鼠腹腔注射3 d后，以5 ml/kg的CCl4和橄榄油(按20 ∶80的体积之比)灌胃，2次/周，第3周给予DEN 50 mg/kg腹腔注射1次，同时给予含9%乙醇饮用水，第4周开始加大CCl4剂量至8 ml/kg灌胃至18周，对荷瘤小鼠进行药物干预。

1.3 荷瘤小鼠的药物干预

空白组5只小鼠正常饲养，不做处理。取构建好的荷瘤小鼠进行药物干预：PBS组及青蒿素组分别腹腔注射PBS及青蒿素(100 mg/kg)，隔日1次，连续作用3周，实验结束处死小鼠，分离肿瘤组织。p-JAK2多肽+青蒿素组腹腔注射p-JAK2多肽[100 μmol/(L·kg)]，隔日注射一次，注射3次后，再用青蒿素(100 mg/kg)联合p-JAK2多肽[10 μmol/(L·kg)]作用，隔日1次，连续作用3周，处死小鼠，分离小鼠的肿瘤组织。

1.4 免疫荧光组织化学检测JAK2/STAT3的活化

将上述方法分离的各组小鼠的部分肿瘤组织，冰冻切片，加一抗4 ℃过夜，荧光标记的二抗37 ℃作用1 h，荧光显微镜观察肿瘤组织中JAK2和STAT3的活化情况。实验平行重复3次。

1.5 Western blot检测肿瘤组织中Caspase 3和P53的表达

提取上述方法分离的各组小鼠的部分肿瘤组织中的蛋白，用10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，加一抗4 ℃过夜，二抗37 ℃作用1 h，应用Image Lab凝胶成像系统检测肿瘤组织中Caspase 3和P53的表达水平。实验平行重复3次。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 青蒿素诱导荷瘤小鼠肝癌组织凋亡情况

成功构建小鼠模型，分离肿瘤组织并提取蛋白，Western blot结果显示，荷瘤小鼠经青蒿素作用后，凋亡蛋白Caspase3表达较空白组及PBS组显著升高(见表1，图1)。

组别 Caspase3FP空白组142．637<0．001PBS组0．86±0．08青蒿素组2．53±0．20∗

与空白组和PBS组相比，*P<0.001

1.空白组;2.PBS组;3.青蒿素组 图1 青蒿素诱导肿瘤组织细胞凋亡情况Figure 1 Apoptosis induced by artemisinin in tumor tissues

2.2 青蒿素抑制肝癌组织JAK2/STAT3信号通路的活化情况

通过免疫荧光检测发现，荷瘤小鼠JAK2的磷酸化水平(p-JAK2)及STAT3磷酸化水平(p-STAT3)较之空白组明显升高，同时经青蒿素作用后，荷瘤小鼠JAK2和STAT3磷酸化水平又显著降低(见图2)。结果提示，青蒿素可以抑制肿瘤组织JAK2，STAT3的磷酸化激活。

图2 免疫荧光检测肿瘤组织JAK2/STAT3的活化情况 (×400)Figure 2 The activation of JAK2/STAT3 in tumor tissues by immunofluorescence histochemistry (×400)

2.3 青蒿素通过JAK2/STAT3通路诱导肝癌细胞凋亡情况

为了进一步验证青蒿素通过活化JAK2/STAT3信号通路对肿瘤凋亡的影响，加入了pJAK2多肽。Western blot结果显示，加入pJAK2多肽后肝癌细胞中的JAK2/STAT3信号通路被显著活化(见表2，图3A)；同时可以显著降低肿瘤的凋亡蛋白Caspase3的表达(见表3，图3B)。结果进一步证明了青蒿素通过抑制JAK2/STAT3信号通路抑制细胞的凋亡。

组别p⁃JAK2p⁃STAT3PBS组11P⁃JAK2多肽组3．48±0．672．51±0．51 t6．4455．134 P0．0030．007

组别Caspase3FP空白组176．531<0．001PBS组0．94±0．30青蒿素组3．67±0．52∗pJAK2多肽+青蒿素组1．17±0．53

与其他三组相比，*P<0.05

图3 pJAK2多肽激活JAK2/STAT3后细胞的凋亡情况Figure 3 Apoptosis after JAK2/STAT3 activation induced by pJAK2 polypeptide

3 讨论

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，病死率极高。目前，治疗肝癌的化疗药物主要是以细胞毒性药物为主。细胞毒性药物不仅杀死肝癌细胞，而且正常的肝细胞也受到损害。因此，寻找治疗效果好、毒副作用小的抗肝癌药物成为研究热点。青蒿素是我国首次发现的，具有很强的抗疟活性的药物。近年来又发现青蒿素类药物具有较强的抗肿瘤作用[4]。研究发现，青蒿素作用荷瘤小鼠后，可以使荷瘤小鼠肿瘤得到显著抑制，同时小鼠的生存时间可以明显延长[5]。本研究成功构建小鼠肝癌模型，通过青蒿素作用荷瘤小鼠后发现，小鼠肿瘤组织的凋亡显著增加。因此，我们认为肝癌细胞对青蒿素具有良好的凋亡敏感性。

JAK2/STAT3信号通路是细胞因子激活相关的信号转导通路，主要参与细胞增殖、分化、凋亡以及免疫调节等过程。越来越多的研究发现JAK/STAT信号通路在多种肿瘤组织中被异常激活而高表达[6]。研究发现，JAK/STAT3 信号通路在多种肝癌细胞系中均有异常活化[7]。JAK/STAT 信号通路过度活化在肝细胞性肝癌的发生和发展过程中起重要作用，并作为评价肝细胞性肝癌恶性程度及预后的重要生物学指标[8]。为了验证青蒿素诱导肝癌细胞凋亡是否与JAK2/STAT3信号通路有关联，青蒿素作用后JAK2/STAT3的表达情况首先被检测，结果证明青蒿素可以显著抑制JAK2/STAT3的活化。那么，青蒿素的这种抑制作用是否就是其诱导凋亡的机制呢？pJAK2多肽激活JAK2/STAT3信号通路使结果得到进一步验证。当JAK2/STAT3信号通路被持续激活后，青蒿素抑制JAK2/STAT3信号活化被阻断，结果显示青蒿素诱导的凋亡作用被明显的抑制，因此我们认为青蒿素主要通过抑制JAK2/STAT3信号通路的活化来发挥抗肿瘤作用。

综上所述，青蒿素抗肝癌细胞活性主要通过抑制JAK2/STAT3信号活化发挥作用，进一步拓宽了对青蒿素抗肿瘤的认识，为增强其抗肿瘤活性提供了基础。

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Effect of artemisinin inhibiting JAK2/STAT3 pathway on apoptosis of hepatocellular carcinoma cells

GUO Jiapei, GUO Bin, LI Leilei, LIU Dianxing, SHI Jun, WU Jinghua*

(DepartmentofLaboratoryMedicine,AffiliatedHospitalofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China;*Correspondingauthor,E-mail：tswujinghua@163.com)

ObjectiveTo explore the anti-tumor mechanism of artemisinin by investigating effects of artemisinin on JAK2/STAT signal patway in the hepatocellular carcinoma(HCC).MethodsThe C57BL/6J HCC model mice were induced with diethylnitrosamine(DEN) injection and intragastric administration of CCl4.Fifteen HCC model mice were randomly divided into PBS group, artemisinin group and polypeptide+artemisinin group, and 5 normal mice were used as control group. The mice were intraperitoneally injected with PBS and artemisinin(100 mg/kg) for three weeks in PBS group and artemisinin group, respectively, and then the mice were killed. Mice in polypeptide+artemisinin group were killed after intraperitoneal injection of polypeptide[100 μmol/(L·kg)] every other day for one week and then treatment with artemisinin for three weeks. After tumor tissues were separated, the expression of caspase 3 in tumor tissues was detected by Western blot, and the expression of p-JAK2 and p-STAT3 was measured with immunofluorescence histochemistry.ResultsThe C57BL/6J mice of HCC models were successfully constructed. The expression of Caspase 3 was significantly increased in tumor tissues after treated with artemisinin(P<0.001), while the p-JAK2 and p-STAT3 were decreased significantly(P<0.05). Compared with artemisinin group, Caspase 3 expression was decreased significantly after preconditioning with pJAK2 in polypeptide+artemisinin group(P<0.05).ConclusionArtemisinin may play a vital role in anti-tumor by inducing the apoptosis of hepatocellular carcinoma cells through inhibiting the activation of JAK2/STAT3 signal pathway.

hepatocellular carcinoma(HCC); artemisinin; JAK2/STAT3; apoptosis

河北省自然科学基金资助项目(H2016209007)

郭佳培，女，1991-02生，在读硕士，初级检验师，E-mail：806364261@qq.com

2016-11-24

R735.7

A

1007-6611(2017)02-0097-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.02.001