物理改性对大豆蛋白柔性与乳化性的影响及其相关性分析

王喜波 王 健 张泽宇 陈 爽 高婷婷 江连洲

(东北农业大学食品学院，哈尔滨150030)

物理改性对大豆蛋白柔性与乳化性的影响及其相关性分析

王喜波 王 健 张泽宇 陈 爽 高婷婷 江连洲

(东北农业大学食品学院，哈尔滨150030)

通过不同物理改性方法(热处理、超声处理、高压均质处理、微波处理)分别得到不同柔性的大豆分离蛋白(SPI)，并利用SPI对胰蛋白酶的敏感性表征柔性，研究物理改性对SPI柔性与乳化性的影响并分析两者之间的相关性。结果表明，各改性方式对SPI柔性和乳化性产生不同的影响且乳化性随柔性的上升而上升。与其他处理条件相比，121℃热处理10min得到最高的柔性和乳化活性，高压均质处理对SPI柔性影响小但对乳化活性影响大。相关性分析结果表明:热处理、超声处理条件下SPI柔性与乳化活性、乳化稳定性呈极显著正相关，相关系数分别为0.969、0.950和0.942、0.954。超高压均质处理条件下SPI柔性与乳化活性、乳化稳定性呈正相关，相关系数分别为0.771、0.720。微波处理条件下SPI柔性与乳化活性呈极显著正相关，与乳化稳定性呈显著正相关，相关系数分别为0.976、0.862。

大豆分离蛋白;柔性;乳化性;物理改性;相关性分析

引言

大豆分离蛋白(SPI)由于其良好的功能性质和营养价值而一直成为国内外的研究热点并被广泛应用于食品的多个领域［1－3］。大豆分离蛋白的功能性质包括起泡性、乳化性、溶解性、凝胶性等，普遍认为与蛋白的浓度、溶解度［4］、表面疏水性［5］、分子量［6］等相关。蛋白柔性定义为蛋白中各个结构域的相对运动或者其多肽链中氨基酸残基的重新取向松弛率［7］。因其在决定蛋白功能性质尤其是界面功能性质中的关键作用而受到越来越多学者的关注。

TANG等［8］研究牛血清蛋白结构与功能性质关系时发现，柔性越高的蛋白越易在界面形成更好的粘弹性蛋白膜，从而表现出更好的乳化性质。KATO等［9］利用不同蛋白对胰蛋白的敏感性来表征柔性，结果发现起泡性、乳化性与蛋白柔性具有较好的相关性，因此认为蛋白柔性是影响乳化性和起泡性的重要因素。POON等［10］通过破坏S-S和非共价键得到不同柔性的蛋白，探究蛋白柔性与乳化能力的关系，并发现蛋白柔性的增加提高了蛋白乳化能力。这些研究主要从化学改性的角度研究蛋白柔性与功能性质的关系，而柔性与功能性质在物理改性条件下的关系尚未见报道研究。

本文采用加热、超声、高压均质、微波等不同方式处理SPI，研究不同处理方式对SPI柔性的影响，并分析和建立SPI柔性与乳化性相关性关系，为进一步研究 SPI结构与功能性质的关系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆由东北农业大学大豆研究所提供;大豆油(九三集团哈尔滨惠康食品有限公司);三氯乙酸(永华精细化学品有限公司);SDS、Tris、胰蛋白酶(Sigma公司);其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

T18 Basic型高速分散机/匀浆机(德国IKA公司);LD4-2A型低速离心机(北京医用离心机厂); TU-1800型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);ALPHA 1-4 LSC型冷冻干燥机(德国Christ公司);ALC-310.3型分析天平(德国艾科勒ACCULAB公司);恒温数显水浴锅(赛普实验仪器厂);实验型高压均质机(英国 Stansted Fluid Power公司);超声波细胞破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司);KD238-DA型微波炉(广东美的微波炉制造有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 SPI制备

参照SORGENTINI等［11］方法并略作改动。大豆去皮、粉碎后过60目筛，乙醚脱脂，脱脂后豆粉与蒸馏水以0.1 g/mL的料液比混合，调pH值至8.5，室温(25℃)低速搅拌2 h溶解。离心(4 000 g) 20min，取上清液，用2 mol/L HCl调pH值至4.5，4℃静置12 h，去上清液，离心(4 000 g)5 min，水洗沉淀，离心2次，沉淀复溶调其pH值至7.0后冷冻干燥。

1.3.2 SPI组分测定

蛋白含量测定参照GB 5009.5—2010;含水率测定参照GB 5009.3—2010;灰分含量的测定参照GB 5009.4—2010;粗脂肪含量的测定参照 GB/T 14772—2008。

1.3.3 样品制备

将SPI溶于缓冲液(0.2mol/L、pH值7.0磷酸盐缓冲液)，质量浓度为20mg/mL，室温搅拌2 h，再用分散机(10 000 r/min)处理1min，静置12 h。

1.3.4 热处理

将制备好的样品在不同温度60、70、80、90、100℃(水浴)及121℃(灭菌锅)处理10min，迅速冰水冷却5min备用。

1.3.5 超声处理

选择超声功率100～800W、处理时间10 min，将超声仪探头浸入样品液面约2 cm进行超声处理，并将样品置于冰水浴中。

1.3.6 高压均质处理

选择均质压力为100～450 MPa，对样品进行高压均质处理，均质次数为1次。

1.3.7 微波处理

选择微波处理功率为800W，处理时间为20～60 s，单次处理量为100mL。

1.3.8 柔性测定

参照KATO等［12］的方法略作改动。利用SPI对胰蛋白酶的敏感性来表征柔性。取250μL质量浓度1mg/mL的胰蛋白酶溶液(0.05mol/L、pH值8.0的Tris-HCl缓冲液)加入到4mL 1mg/mL处理后蛋白溶液中(蛋白溶液与胰蛋白酶溶液体积比16∶1)，38℃保温酶解5 min，酶解反应结束后，加4mL 5%TCA终止酶解反应，离心，取上清液在280 nm测定其吸光度。用吸光度A表示柔性。

1.3.9 乳化性测定

参照TANG等［13］的方法，将改性后的蛋白样品稀释到2mg/mL，处理后蛋白样品与大豆油以体积比3∶1的比例混合，分散机(10 000 r/min)处理1min，迅速吸取底部乳液50μL加入到5 mL 0.1% SDS溶液中，混合均匀。分别测定0 min和10 min吸光度，乳化活性(EAI)用吸光度A表示，乳化稳定性计算公式为

式中 W——乳化稳定性，min

A0——0min时测得的吸光度

A10——10min时测得的吸光度

1.3.10 数据统计分析

每次试验做3次平行，结果用平均值±标准差表示，组间差异显著性采用t检验分析(p＜0.05)。数据统计分析采用 SPSS 17.0软件，试验数据用Origin 9.0软件绘制趋势曲线图。

2 结果与分析

2.1 大豆分离蛋白的组成

试验所制得的SPI蛋白质、水分、灰分和粗脂肪质量分数分别为(87.22±0.44)%、(3.24± 0.67)%、(3.39±0.53)%和(0.47±0.06)%，符合试验要求。

2.2 不同物理改性对大豆分离蛋白柔性和乳化性的影响

由图1(图中不同小写字母表示柔性差异显著，下同)和图2(图中不同小写字母表示乳化活性差异显著，不同大写字母表示乳化稳定性差异显著，下同)可以看出，当处理温度低于80℃时，热处理对SPI柔性的影响不大，当热处理温度大于80℃时，随着热处理温度的提高，SPI的柔性不断上升，并在121℃时柔性达到最高。伴随着柔性上升，SPI乳化活性和乳化稳定性也不断上升，这与PALAZOLO等［14］的结果相似，该研究也认为适当的热处理可以有效地提高大豆蛋白的乳化性质。而KATO等［15］研究热处理对大豆伴球蛋白功能性质影响发现，乳化性(乳化活性和乳化稳定性)与表面疏水性指数呈线性相关。

图1 不同热处理条件对SPI柔性的影响Fig．1 Effect of different heat treatment conditions on flexibility of soy protein isolate

图2 不同热处理条件对SPI乳化性的影响Fig．2 Effect of different heat treatment conditions on emulsion property of soy protein isolate

蛋白的柔性受氢键、范德华力、静电引力和疏水相互作用等非共价键影响，高于80℃的热处理可以破坏这些键从而使SPI紧密的结构伸展开［16］，柔性增大。而处理温度为121℃时，蛋白柔性显著增大，可能是由于高温处理使蛋白分子内二硫键断裂［17］，造成柔性增加。柔性蛋白能快速吸附到界面，使SPI更容易形成界面膜，从而改善大豆分离蛋白的乳化性能［8，18－19］。

从图3、4可以看出，当处理功率小于300W时，随着功率的增加，SPI乳化活性和乳化稳定性都随柔性增加而增加，当处理功率大于300W时，三者变化都不大。有研究表明，超声产生的空化效应和机械效应会破坏蛋白质的四级结构，同时释放出小分子的亚基和肽［20］，使蛋白柔性增加而导致乳化性的上升。JAMBRAK等［21］研究表明，超声处理可降低蛋白粒径，使蛋白质分子质量显著降低，还可改变蛋白中柔性区域与刚性区域的组成，从而降低了蛋白柔性。

图3 不同超声处理条件对SPI柔性的影响Fig．3 Effect of different ultrasonic treatment conditions on flexibility of soy protein isolate

由图5、6可以看出，随着均质压力的升高，SPI柔性升高，在均质处理压力为350MPa时达到最高，随后下降。而SPI乳化活性在300 MPa时达到最高，乳化稳定性则在不断地上升。这归因于高压均质产生的压力作用、高频振荡和对流撞击等机械力使SPI结构发生改变，增加了柔性，从而造成乳化性的提升［22－23］。

图4 不同超声处理条件对SPI乳化性的影响Fig．4 Effect of different ultrasonic treatment conditionson emulsion property of soy protein isolate

图5 不同高压均质处理条件对SPI柔性的影响Fig．5 Effect of different high pressure homogenization conditions on flexibility of soy protein isolate

图6 不同高压均质处理条件对SPI乳化性的影响Fig．6 Effect of different high pressure homogenization conditions on emulsion property of soy protein isolate

由图7、8可以看出，随着微波处理时间的延长，SPI乳化活性和乳化稳定性随柔性上升都呈上升趋势，可能是由于微波场诱导SPI分子体系产生极化现象破坏了SPI的刚性结构，使柔性增加，内部的疏水残基暴露在蛋白表面，更容易在界面上展开和重排，促进水-油界面的形成［18－19］，使大豆分离蛋白乳化性质提高。BOHR等［24］研究微波处理对球状蛋白构象的影响，发现微波处理可促进蛋白质结构的柔性展开，使蛋白质柔性增加，进而改善蛋白质的功能特性。

图7 不同微波处理条件对SPI柔性的影响Fig．7 Effect of differentmicrowave treatment conditions on flexibility and emulsion stability of soy protein isolate

图8 不同微波处理条件对SPI乳化性的影响Fig．8 Effect of differentmicrowave treatmentconditions on emulsion property of soy protein isolate

2.3 SPI柔性与乳化性相关性分析

为了进一步分析柔性与乳化活性及乳化稳定性之间的关系，利用Origin 7.5对其关系进行函数拟合，结果见图9、10。

图9 4种改性条件下SPI柔性与乳化活性的关系Fig．9 Relatiionships of emulsifying activity with flexibility of soy protein isolate combined with fourmodification conditions

由图9、10可知，经过热处理、超声处理、高压均质处理和微波处理以后，随着柔性的增加，乳化性和乳化稳定性呈现递增趋势，具有良好的线性相关关系，相关系数如表1所示。相对于其他处理条件，121℃热处理10 min能得到最高的柔性和乳化活性，高压均质处理对SPI柔性影响小却对乳化活性影响大。

图10 4种改性条件下SPI柔性与乳化稳定性的关系Fig．10 Relatiionships of emulsion stability with flexibility of soy protein isolate combined with fourmodification conditions

表1 4种改性条件下乳化活性、乳化稳定性与柔性相关性系数Tab．1 Correlation coefficients of emulsifying activity and emulsion stability w ith flexibility of soy protein combined w ith four modification conditions

由表1可知，热处理、超声处理条件下SPI柔性与乳化活性、乳化稳定性呈极显著正相关，相关性系数分别为0.969、0.950和0.942、0.954。超高压均质处理条件下SPI柔性与乳化活性、乳化稳定性呈正相关，相关系数分别为0.771、0.720。微波处理条件下SPI柔性与乳化活性呈极显著正相关，与乳化稳定性呈显著正相关，相关性系数分别为0.976、0.862。

TORNBERG［25］认为在形成乳液的过程中蛋白质分子首先通过扩散和/或对流作用从体相溶液扩散到界面附近，并形成界面层，此过程受蛋白浓度、蛋白粒度、表面疏水性等因素的影响;其次，大部分蛋白质分子在界面发生结构展开;最后，吸附的蛋白质分子以更加紧凑的结构在界面上重排。不同的物理改性方法以不同的方式破坏了SPI的刚性结构，造成柔性的上升，使SPI更容易在界面展开并快速吸附，从而提高了SPI的乳化性(乳化活性、乳化稳定性)。这与KITTIPHATTANABAWON［26］的观点一致。KREBS等［27］探究了蛋白质分子结构特性与界面蛋白构象变化的关系，证实了柔性蛋白比球蛋白更易在界面上展开和重排。MIN等［28］采用尿素和二硫基苏糖醇(DTT)分别破坏维系蛋白质分子刚性结构的非共价和二硫键，得到更加柔性的蛋白，从而加速了蛋白质分子在界面上的展开和重排。

也有理论认为，由于能垒的存在，当蛋白质分子到达界面后，不能立刻发生吸附，需要克服能垒后才能发生真实的吸附，能垒的大小与蛋白质分子表面和界面间相互作用的情况相关［29］。通过外加处理改变SPI柔性也许可以降低吸附过程的能垒，从而提高SPI的乳化性质［30］。

3 结论

(1)各个改性方式对SPI柔性和乳化性产生不同的影响且乳化性随柔性的上升而上升。与其他处理条件相比，121℃热处理10 min得到最高的柔性和乳化活性，高压均质处理对SPI柔性影响小但对乳化活性影响大。

(2)热处理、超声处理条件下SPI柔性与乳化活性、乳化稳定性呈极显著正相关，相关系数分别为0.969、0.950和0.942、0.954。超高压均质处理条件下SPI柔性与乳化活性、乳化稳定性呈正相关，相关系数分别为0.771、0.720。微波处理条件下SPI柔性与乳化活性呈极显著正相关，与乳化稳定性呈显著正相关，相关性系数分别为0.976、0.862。

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Effect of Physical Modification on Flexibility and Emulsifying Property of Soy Protein and Its Correlation Analysis

WANG Xibo WANG Jian ZHANG Zeyu CHEN Shuang GAO Tingting JIANG Lianzhou
(College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

Effect of different physicalmodification conditions(heating treatment，ultrasound treatment，high-pressure treatment，homogenization treatment and microwave treatment)on emulsifying properties and flexibility characterized by sensitivity to trypsin of soy protein isolatewas investigated．The correlation analysis between flexibility and emulsifying properties(emulsifying activity and emulsion stability)was also investigated．The results suggested that different physicalmodification methods had different effects on flexibility and emulsifying properties of soy protein isolate，and emulsifying activity and emulsion stability were increased with the increase of flexibility．The best flexibility and emulsifying activity were got at121℃ with 10min heating treatment，comparingwith other physicalmodification conditions．Highpressure homogenization treatment had little impact on flexibility but it had great impact on emulsifying activity．Correlation analysis suggested that soy protein isolate flexibility was very significantly and positively correlated with emulsifying activity and emulsion stability under heating and ultrasound treatment conditions，correlation coefficients were 0.969，0.950 and 0.942，0.954，respectively．Flexibility of soy protein isolate was positively correlated with emulsifying activity and emulsion stability under high-pressure treatment conditions，correlation coefficients were 0.771 and 0.720，respectively．Flexibility of soy protein isolate was very significantly and positively correlated with emulsifying activity and emulsion stability under microwave treatment conditions，correlation coefficients were 0.976 and 0.862，respectively．

soy protein isolate;flexibility;emulsifying properties;physical modification;correlation analysis

TS201.2

A

1000-1298(2017)07-0339-06

2016-11-12

2016-12-17

国家大豆产业技术体系项目(CARS-04-PS25)

王喜波(1975—)，男，副教授，主要从事粮食、油脂及植物蛋白工程研究，E-mail:wangxibo@neau．edu．cn

江连洲(1960—)，男，教授，博士生导师，主要从事粮食、油脂及植物蛋白工程研究，E-mail:jlzname@163．com

10．6041/j．issn．1000-1298．2017．07．043