河南省大白菜根肿病菌生理小种鉴定

原玉香，赵艳艳，魏小春，姚秋菊，蒋武生，王志勇，李扬，许茜，杨双娟，张晓伟*

(1.河南省农业科学院园艺研究所，河南郑州450002;2.郑州大学生命科学学院，河南郑州450000)

河南省大白菜根肿病菌生理小种鉴定

原玉香1，赵艳艳1，魏小春1，姚秋菊1，蒋武生1，王志勇1，李扬2，许茜2，杨双娟1，张晓伟1*

(1.河南省农业科学院园艺研究所，河南郑州450002;2.郑州大学生命科学学院，河南郑州450000)

为了明确河南省大白菜根肿病菌的生理小种类型，从新野县十字花科蔬菜种植基地采集2份大白菜根肿病菌样品(XY－1为原始菌，XY－2为新引菌)，采用菌液注射接种法，利用Williams和ECD 2套鉴别系统分别对其进行生理小种鉴定。结果显示，采用Williams鉴别系统鉴定的2份大白菜根肿病菌生理小种相同，均为4号生理小种;采用ECD鉴别系统鉴定的大白菜根肿病菌生理小种明显不同，原始菌XY－1为ECD16/15/31，新引菌XY－2为ECD21/31/31，后者较前者的致病性更强。以上结果表明，Willams鉴别系统有一定的局限性，当病原菌致病力强于4号生理小种时无法区分，而ECD鉴别系统由于所用寄主数量及种类较多，可以将4号生理小种进一步区分为不同的类型，鉴定结果更为精确。

大白菜;根肿病菌;生理小种;Williams系统;ECD鉴别系统

根肿病是由根肿菌目芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woron.)侵染十字花科植物根部引起植株萎蔫凋亡的一种世界性土传病害［1］。根肿病菌被归为原生界根肿菌门［2］，其通过侵染十字花科植物根毛导致根部薄壁细胞增生而形成肿瘤［3］。该病害分别于18世纪30年代和19世纪70年代在地中海西岸(英国)和欧洲南部(前苏联列宁格勒)发现，现今全世界多个国家均有分布［4］。在我国，黄齐望等［5］首次报道了江西省发生十字花科根肿病，目前，该病在国内27个省、市、自治区都有分布［6］。新野县是河南省最大的十字花科蔬菜种植基地，于2007年在大白菜上发现根肿病，近年来，该病蔓延非常迅速，发生面积急剧增加。尤其是2015年8—9月，当地菜农在秋大白菜育苗时不慎购用了某公司生产的带有根肿菌的育苗基质，致使原本抗当地根肿病的大白菜新品种在苗龄20多天时严重感病，给菜农带来了极大的损失，严重威胁着当地十字花科蔬菜的可持续生产。

在根肿病菌生理小种分化研究方面，Honig［7］首次证实该病原菌存在生理小种分化。目前，国际上通用的根肿病菌生理小种鉴别系统有2套:Williams系统和ECD系统(European clubroot differential series，欧洲根肿病菌生理小种鉴别系统)［8-9］。Williams鉴别系统由2个结球甘蓝和2个芜菁甘蓝共4个鉴别寄主组成，ECD系统由白菜组、甘蓝型油菜组和甘蓝组各5个鉴别寄主组成［8-9］。目前，全世界已鉴定出24个以上的生理小种［10］。在我国，沈向群等［11］已从辽宁、山东、云南、四川、吉林等地区采集的大白菜根肿病菌中初步鉴定出了4、2、7、10、11号等共5个生理小种，丁云花等［12］从我国8省(市) 18份根肿病菌中鉴定出了4、7、2号共3个生理小种。上述根肿病菌生理小种鉴定均采用Williams系统，目前，国内尚无利用ECD系统对大白菜根肿病菌生理小种进行鉴定的报道。

本试验采用菌液注射接种法，利用Williams和ECD 2套鉴别系统，对采自河南省南阳市新野县城郊乡的2份大白菜根肿病原菌XY－1(新野原始菌)和XY－2(基质新引菌)进行生理小种鉴定，旨在明确其生理小种类型，为河南大白菜根肿病研究和抗根肿病育种研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试根肿病菌2份供试根肿病原菌分别为XY－1和XY－2，均采集于河南省新野县城郊乡吕庄村。XY－1为田间大白菜发病植株的病根，代表新野当地原始菌;XY－2为育苗基质中发病大白菜幼苗肿根，代表因基质带菌而引入新野的新菌。将其新鲜的膨大根瘤洗净后，晾干表面水分，密封于自封袋中，于－20℃冰箱中保存。

1.1.2 鉴别寄主分别采用Williams和ECD鉴别系统进行根肿病菌生理小种鉴定［8-9］。Williams鉴别系统包括Jersey Queen(JQ)、Badger Shipper(BS)、Laurentian(LT)及Wilhelms burger(WB)。ECD鉴别系统由白菜(B.rapa L.)(2n=20)、甘蓝型油菜(B.napus L.)(2n=38)和甘蓝(B.oleracea L.)(2n= 18)3组芸薹属寄主共15个品种(系)组成。ECD05是结球白菜(B.rapa var.pekinensis)品种Granaat，在ECD鉴别系统中被作为感病对照;ECD12是抗根肿病的结球甘蓝亲本材料［9］;ECD鉴别系统中的鉴别寄主ECD11和ECD13分别对应于Williams鉴别系统中的结球甘蓝BS和JQ。ECD鉴别寄主种子由加拿大曼尼托巴大学栗根义教授提供，Williams鉴别寄主中的2个甘蓝型油菜品种LT及WB种子由北京市农林科学院蔬菜研究中心余阳俊研究员提供。

1.2 试验方法

1.2.1 菌液注射接种试验于2015年3—10月在河南省农业科学院园艺研究所位于新野的根肿病抗性鉴定圃大棚内进行，菌液制备和接种方法参考丁云花等［12］的方法。

播种后每穴注射1 mL菌液进行接种，接种悬浮液孢子浓度为1×107个/mL。在利用Williams和ECD系统进行生理小种鉴定试验中，每份菌样分别同时接种4个和15个鉴别寄主，以高感材料豫新55为对照。Williams鉴别寄主和ECD寄主每个品种分别接种30株和50株，接种后45 d左右，对照正常发病且为7级时进行调查。

1.2.2 病情调查病情分级标准参照农业部公益性行业(农业)科研专项(201003029)制定的标准。0级:根部无肿瘤;1级:侧根有小肿瘤;3级:主根肿大，其直径小于2倍茎基部;5级:主根肿大，其直径为茎基部的2～3倍;7级:主根肿大，其直径为茎基部的3倍以上。根据发病级别计算病情指数，病情指数小于10为抗病，病情指数等于10或以上为感病［13］。

1.2.3 生理小种的划分标准分别根据Williams和Buczacki制定的十字花科根肿病菌鉴别系统，按照病原菌在寄主上的抗感反应来确定其生理小种类型［8-9］。在利用Williams鉴别系统进行根肿病菌生理小种鉴定时，如果JQ、LT和WB这3个寄主对病原菌表现感病，而BS表现抗病，则该病菌被确定为1号生理小种;若JQ、BS和LT表现感病，而WB表现抗病，则确定为2号生理小种;其余依次类推，其抗感反应详见表1［8］。

表1 十字花科根肿病菌Williams鉴别系统的寄主反应

在经ECD鉴别系统鉴定根肿病菌未知生理小种时，白菜、甘蓝型油菜和甘蓝这3组寄主材料都有固定的顺序，根据每组寄主分别对病原菌的抗感反应，由寄主所得进制值计算结果命名生理小种(表2)。命名时，若寄主对病原菌表现为抗病，则记为“0”;若表现为感病，则取相对应的十进制数值进行累计计算。例如，B.rapa组的5个寄主中仅ECD 05寄主表现感病，B.napus组仅ECD 10寄主表现抗病，B.oleracea组中5个寄主全部感病，那么经查表2可获得对应二进制和十进制数值，二进制计算方法表述为:ECD 0+0+0+0+24/20+21+22+23+ 0/20+21+22+23+24;其十进制计算方法为:ECD 0+0+0+0+16/1+2+4+8+0/1+2+4+8+16。该套寄主群体的总值分别为16、15和31，该小种应该命名为ECD16/15/31。

表2 十字花科根肿病菌ECD鉴别系统及寄主对应的二进制、十进制值

2 结果与分析

2.1 Williams鉴别系统的鉴定结果

从表3可知，采自河南新野的大白菜根肿病菌XY－1和XY－2在4份鉴别寄主上的反应相同，均表现为感病，说明2份病菌均为4号生理小种。其中，XY－2的生理小种鉴定结果如图1所示。

表3 基于Williams鉴别寄主的河南新野大白菜根肿病菌生理小种鉴定

续表3基于Williams鉴别寄主的河南新野大白菜根肿病菌生理小种鉴定

图1 利用Williams鉴别系统对XY－2的鉴定结果

2.2 ECD鉴别系统的鉴定结果

从表4可知，原始菌XY－1和新引菌XY－2在15份寄主上的抗感反应明显不同，原始菌XY－1除了ECD 01、02、03、04和ECD 10表现为抗病外，其余均表现为感病，故生理小种为ECD16/15/31(或ECD0+0+0+0+24/20+21+22+23+0/20+21+ 22+23+24)，而新引菌XY－2除了ECD 02和ECD 04表现为抗病外，其余均表现为感病，其生理小种为ECD21/31/31(或ECD20+0+22+0+24/20+ 21+22+23+24/20+21+22+23+24)，因此，基于ECD鉴别系统鉴定的大白菜根肿病菌生理小种明显不同，后者较前者致病性更强。其中，XY－2的生理小种鉴定结果如图2所示。

表4 基于ECD鉴别寄主的河南新野大白菜根肿病菌生理小种鉴定

图2 利用ECD鉴别系统对XY－2的鉴定结果

2.3 大白菜材料对2种菌的抗感反应

为了进一步比较2种根肿病菌的致病性差异，以3份DH系、10份杂种一代(F1)和27份高代自交系大白菜为试材进行接种试验，调查结果显示，除2份F1(Y664和Y642)和2份高代自交系(14CR440和14CR345)抗2种病菌外，其余对XY－1表现为抗病的材料对XY－2均失去了抗性(表5)。

表5 40份大白菜材料对2种病菌的抗感反应

3 结论与讨论

根肿病是一种非常难防治的病害，被称为十字花科蔬菜的“癌症”，其中一个重要原因是根肿病菌生理小种分化比较多。对根肿病的研究包括抗病育种一定要对根肿菌生理小种的分化进行鉴定，才能有针对性地对不同地区根肿病进行有效防治并选育出适合不同地区种植的抗性品种［13］。国外研究根肿病菌小种划分起步较早，部分实验室甚至通过根肿菌单孢菌系的建立，完成了单孢菌系ECD小种的划分，并对生理小种进行了分子鉴定，获得了小种特异的分子标记［14-19］。我国根肿病菌生理小种研究尚处于起步阶段，缺乏系统的鉴别方法研究，特别是由于ECD系统中鉴别寄主的冬性很强，15个寄主很难在国内大量获取种子，使得目前还未见采用ECD系统对国内不同地区根肿病菌进行生理小种划分的系统研究报道。

国内学者在十字花科根肿病菌生理小种鉴定方面的报道虽较多，但均是利用Williams鉴别系统鉴定生理小种，本研究首次利用ECD鉴别系统对来自同一地区的2份不同大白菜根肿病菌生理小种进行了鉴定。从鉴定结果来看，基于Williams鉴别系统，来自河南省南阳市新野县城郊乡吕庄村的2份根肿病菌均为4号生理小种，表明目前河南新野十字花科蔬菜产区的大白菜根肿病菌优势小种为4号生理小种，这与沈向群等［11］的报道一致。目前的Willams鉴别系统存在一定的局限性，因为根据该鉴别系统的命名原则，能使4个鉴别寄主均感病的病原菌菌株为4号生理小种，但随着病原菌致病力的进一步分化，出现强于4号生理小种菌株时，Willams鉴别系统将不能满足鉴定需要;因此，亟需调整和补充新的鉴别寄主，形成一套适合不同类型根肿病菌的鉴别系统。本研究中，基于ECD鉴别系统鉴定的2份根肿病菌生理小种明显不同，表明ECD鉴别系统较Williams鉴别系统的结果更为精确，其中，代表由基质新引进的根肿菌XY－2比新野当地原始菌XY－1致病性更强。

现今是生物信息学的时代，分子生物学技术突飞猛进，从分子水平上对根肿菌进行生理小种的划分将是未来发展的一大趋势，如何尽快科学地建立起实用的根肿菌小种鉴别方法，是当前迫切需要解决的关键问题。只有这样才能提高十字花科作物抗病品种选育效率，最终实现对根肿病的持续控制［20-21］。

近年来，随着蔬菜集约化育苗的迅猛发展，基质带菌传播根肿病的现象在河南新野、安阳、济源、原阳等地多处发生，因此，基质带菌传播病害问题应该引起高度重视。如何指导菜农在育苗的过程中选好基质以防基质带菌传播大白菜根肿病，是预防大白菜根肿病传播的一个重要手段，同时尽快选育出抗根肿病菌不同生理小种的新品种是育种工作者义不容辞的责任和使命。

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Pathotype Identification of Plasmodiophora brassicae Woron.Collected from Chinese Cabbage in Henan Province

YUAN Yuxiang1，ZHAO Yanyan1，WEI Xiaochun1，YAO Qiuju1，JIANG Wusheng1，WANG Zhiyong1，LI Yang2，XU Qian2，YANG Shuangjuan1，ZHANG Xiaowei1*
(1.Institute of Horticulture，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China; 2.College of Bioscience，Zhengzhou University，Zhengzhou 450000，China)

In order to clarify the pathotype of Plasmodiophora brassicae Woron.on Chinese cabbage in Henan province，two isolates XY-1 and XY-2 collected from Chinese cabbage clubbed roots in Xinye county，representing original and newly introduced pathogens were identified respectively.The identification was carried out by inoculating spore suspension based on the differential sets of Williams system and ECD system.The result showed that both XY-1 and XY-2 were classified into the pathotype 4 of P.brassicae based on the Williams differential system，while based on the ECD differential system，two different pathotypes were classified with XY-1 as pathotype ECD16/15/31 and XY-2 as pathotype ECD21/31/31.The inoculating test showed that the newly introduced pathogen(XY-2)was more virulent in pathogenicity on Chinese cabbage than the original one(XY-1).The above results indicated that the ECD system was more precise than the Williams system due to lager number and more species of differential hosts used for classification，which could further divide the pathotype 4 into different types.

Chinese cabbage;Plasmodiophora brassicae;pathotype;Williams system;ECD system

S436.341.1

A

1004－3268(2017)07－0071－06

2016－12－09

国家重点研发计划项目(2016YFD0100204－18);国家大宗蔬菜产业技术体系项目(CARS－25－G－27);河南省科技开放合作项目(162106000011);河南省专项资金项目(20157805);河南省农业科学院科研发展基金项目(CYC20167804);河南省农业科学院自主创新专项基金项目(2016ZC25)

原玉香(1970－)，女，河南武陟人，研究员，博士，主要从事蔬菜生物技术及遗传育种研究。E－mail:yuxiangyuan126@126.com

*通讯作者:张晓伟(1965－)，男，河南平舆人，研究员，硕士，主要从事蔬菜生物技术育种研究。E－mail:xiaowei5737@163.com