中国三种不同地方品系鸡对J亚群禽白血病病毒NX0101株易感性的比较

栾怀彪，王一新，许书珍，房立春，崔治中，常 爽，赵 鹏

（山东农业大学动物医学院，泰安 271000）

·研究论文·

中国三种不同地方品系鸡对J亚群禽白血病病毒NX0101株易感性的比较

栾怀彪，王一新，许书珍，房立春，崔治中，常 爽，赵 鹏

（山东农业大学动物医学院，泰安 271000）

为了研究不同中国地方品系鸡对J亚群禽白血病病毒（subgroup J Avian leukosis virus，ALV-J）的易感性和抵抗力，将ALV-J中国分离株NX0101分别通过鸡胚静脉和卵黄囊两种接种方式接种莱芜黑鸡、汶上芦花鸡、济宁百日鸡3种不同地方品系鸡，分析比较NX0101株对3种品系鸡的致病性。结果表明，NX0101株均可诱发3种品系鸡的髓样细胞瘤，并引起生长迟缓和免疫抑制等亚临床症状，但致病性的强度差异具有显著统计学意义。在两种不同接种方式下，莱芜黑鸡的死亡率和肿瘤发生率均明显低于另外两个品系，并且感染莱芜黑鸡的体重受抑制程度最低。济宁百日鸡对NX0101株的抵抗力在这3种品系鸡中最弱。因此，莱芜黑鸡可以作为ALV-J遗传抗性基因筛选和抗病育种的候选品系。

丁亚群禽白血病病毒；地方品系鸡；易感性；遗传抗性

禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）是一种能诱发禽类多种肿瘤性疾病的反转录病毒。根据病毒的特异性细胞受体和病毒囊膜蛋白可将ALV分为A-J不同的亚群[1,2]。其中，E亚群是广泛存在于宿主基因组中的内源性病毒，通常不致病或致病性很弱；A、B、J亚群是流行最为广泛且致病性较强的3个外源性病毒亚群，特别是J亚群ALV（ALV-J）给我国养禽业造成了巨大的经济损失[3-8]。由于ALV亚群众多、基因组突变率极高，并且先天感染的雏鸡具有免疫耐受性，因此尚无有效的疫苗可供使用，对该病也没有切实有效的治疗措施[9]。目前，严格的监控和净化是唯一有效的控制ALV的方法[10,11]。

随着分子遗传学的发展，遗传抗病性研究为畜牧生产中防控传染病提供了新的有效途径。特别是近年来，强毒株不断出现，疫苗免疫失败，抗生素残留等问题日益引起人们的关注，筛选培育抗病品种逐渐成为畜禽养殖业的未来发展趋势[12]。充分利用不同品系鸡资源，发现与抗病性状、免疫关联密切的基因和位点，是抗病育种的关键内容。国外有研究证实，编码对外源性ALV感染的细胞易感性和抵抗力的等位基因频率，在不同品系鸡群中差异很大[13,14]。无内源性ALV商品鸡系的成功建立也表明，培育抗病鸡群是一种切实可行的ALV防控措施[15]。中国养禽业历史悠久，资源丰富，具有世界独有的品种基因库。但迄今为止，关于不同地方品系鸡对ALV遗传抗性的系统研究相对较少。谢青梅等[16]曾报道，tvar5和tvar6的突变使得中国某地方品系鸡获得了对ALV-A的遗传抵抗力。

为了比较不同中国地方品系鸡对ALV-J的易感性和抵抗力，本研究选取三种地方品系鸡（济宁百日鸡、寿光黑鸡、汶上芦花鸡）经鸡胚卵黄囊和鸡胚静脉注射两种不同方式接种ALV-J中国分离株NX0101株，通过一系列指标评价NX0101株对3种不同品系鸡群的致病性，以期发现抗性鸡种，为进一步研究不同品系鸡的遗传抗病机制和ALV-J相关抗性基因的筛选奠定基础。

1 材料与方法

1.1 不同品系鸡和病毒来源 济宁百日鸡、莱芜黑鸡、汶上芦花鸡三种我国特有地方品系鸡鸡胚购自山东某地方品系鸡鸡场，均由本实验室孵化。经检测，本实验所使用的三种品系鸡均无ALV、网状内皮增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus，REV）、传染性囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）、鸡传染性贫血病毒（Chicken infectious anemia virus，CIAV）和马立克氏病病毒（Marek’s disease virus，MDV）的先天感染。ALVJNX0101株由本实验室分离、保存[17]。NX0101株于2001年分离自我国宁夏某白羽肉种鸡鸡群，动物实验表明，该毒株具有较强的致病性和致瘤性，被广泛应用于ALV-J的相关研究。将NX0101毒株接种DF-1细胞增殖后按照Reed-Muench法测定其细胞半数感染量（TCID50），该病毒细胞半数感染量为104.2TCID50/0.1 mL。

1.2 动物实验设计 各取150枚济宁百日鸡、莱芜黑鸡和汶上芦花鸡的鸡胚，按照表1所示分组和处理方法进行攻毒并孵化至出壳。所有鸡饲养在9个同等规格的负压隔离罩中。分别于攻毒后1 d、1周、3周、5周、8周、11周、14周、17周、20周、22周时无菌采集血浆，接种DF-1细胞检测各组ALV病毒血症；同时在感染后1、3、5、8、11周采集血清，使用ELISA试剂盒（IDEXX，USA）检测各组ALV-J抗体。试验期间，对自然死亡的鸡剖检并观察，记录死亡率；对发生肿瘤的鸡，将其肿瘤组织制备切片，HE染色后进行病理组织学观察。22周时全部扑杀，观察肿瘤发生情况或病变情况。

为比较NX0101毒株对不同中国地方品系鸡生长增重的抑制作用，在 1、2、3、4、5、6周对所有鸡称重并比较分析。为比较NX0101毒株对不同中国地方品系鸡的免疫抑制作用，在1周时每只鸡接种0.1 mL NDV灭活油乳疫苗（齐鲁动物保健品厂）和AIV-H9灭活油乳疫苗（齐鲁动物保健品厂），并于免疫后3、4、5周采血，分离血清后通过血凝抑制试验检测针对NDV和AIV-H9抗体效价。在免疫后7周，各组随机选取、进行5只鸡剖杀，称其体重以及法氏囊、胸腺和脾脏的重量，按如下方法计算免疫器官指数：免疫器官指数=免疫器官重量（g）/鸡活体重（kg）。

1.3 数据统计分析 不同组别的所有数据采用SPSS 19.0统计软件包处理。

表1 动物实验分组与处理Table 1 Group of animal experiment and treatment

2 结果

2.1 不同地方品系鸡ALV-J病毒血症与抗体动态变化本研究通过两种不同接毒方式对济宁百日鸡、莱芜黑鸡和汶上芦花鸡进行攻毒，在感染后1 d、1周、3周、5周、8周、11周、14周、17周、20周和22周所有时间点，卵黄囊接毒组和静脉接毒组的全部品系鸡均可以检测到病毒血症，阳性率维持在100%。此外，在感染后1、3、5、8周和11周的检测时间点，所有鸡血清中均未检测到ALV-J抗体。

2.2 三个品系鸡静脉接种NX0101的死亡率和肿瘤发生率

2.2.1 静脉接毒组死亡率和肿瘤发生率 结果显示，通过静脉途径接种病毒时，莱芜黑鸡的死亡率（44.0%）显著低于汶上芦花鸡（72.0%）和济宁百日鸡（76.0%）。静脉接毒组的鸡肿瘤发生率如表2所示，莱芜黑鸡的肿瘤发生率最低（8.0%），显著低于汶上芦花鸡（32.0%）和济宁百日鸡（16.0%）。静脉接种组的鸡在整个过程中的生存曲线如图1A所示，3种品系的死亡趋势基本一致，多发生在60日龄之后。在观察期间，剖检死亡的不同品系鸡，均可发现肝脏、脾脏肿大，有的在肝脏上可见点状肿瘤结节，组织切片中可见大量的典型髓样瘤细胞（图2）。

表2 静脉接毒组的死亡率和肿瘤发生率比较Table 2 Comparision of mortality and tumor incidence between different chicken breeds infected with NX0101 intravenously

2.2.2 卵黄囊接毒组死亡率和肿瘤发生率 3种不同品系鸡通过卵黄囊接种NX0101后，孵出饲养至22w。结果表明，当通过卵黄囊途径接种病毒时，莱芜黑鸡的死亡率（48.0%）显著低于汶上芦花鸡（60.0%）和济宁百日鸡（68.0%）。卵黄囊接毒组的鸡肿瘤发生率如表3所示，莱芜黑鸡的肿瘤发生率最低（8.0%），显著低于汶上芦花鸡（12.0%）和济宁百日鸡（20.0%）。卵黄囊接种组的鸡在整个实验过程中的生存曲线如图1B所示，其死亡情况与静脉接毒组的鸡类似。

表3 卵黄囊接毒组的死亡率和肿瘤发生率比较Table 3 Comparision of mortality and tumor incidence between different chicken breeds infected with NX0101 through yolk sac

2.3 NX0101感染对不同地方品系鸡体重的影响 接种NX0101的所有品系鸡均表现生长迟缓，体重增重与空白对照组相比差异具有显著统计学意义（P<0.05），但同种品系、不同接种方式的鸡体重增重差异不具有统计学意义（表4）。这一结果表明，NX0101感染对3种不同品系鸡的生长性能均有抑制作用，但这种抑制作用与病毒的接种方式没有明显相关性。以对照组鸡的体重为标准，计算NX0101感染鸡每周体重增重的抑制比率，并绘制曲线（图1C，图1D）。结果显示，NX0101对体重增重的抑制作用在不同品系鸡之间有较大差异。病毒感染对莱芜黑鸡体重增重的抑制率显著低于另外两个品系，特别是在卵黄囊接毒组中，这种差异表现更为显著。

表4 NX0101对3种品系鸡体重增重的影响Table 4 Inhibitory effect of NX0101 infection on chicken growth

图1 不同方式接种NX0101对不同品系鸡体重增重和死亡的影响Fig.1 Comparison of mortality and growth inhibition induced by NX0101 between different Chinese indigenous breeds.A：鸡胚静脉接种NX0101后不同品系鸡的生存曲线; B：鸡胚卵黄囊接种NX0101后不同品系鸡的生存曲线; C：鸡胚静脉接种NX0101对不同品系鸡体重增重的抑制率; D：鸡胚卵黄囊接种NX0101对不同品系鸡体重增重的抑制率A: Survival curve of different lines of chickens inoculated with NX0101 intravenously; B: Survival curve of different lines of chickens inoculated with NX0101 by yolk sac; C: Inhibition ratio of body weight of different lines of chickens inoculated with NX0101 intravenously; D: Inhibition ratio of body weight of different lines of chickens inoculated with NX0101 by yolk sac

图2 三种中国地方品系鸡通过静脉接种NX0101后出现的大体病变及肿瘤组织显微切片Fig.2 Pathological changes and section of tumor tissues in chickens infected with NX0101 intravenouslyA：死亡黑鸡肝脏肿大, 表面布满针尖状肿瘤结节; B：死亡芦花鸡肝脏肿大, 剖开后有肿瘤结节; C：死亡济宁百日鸡肝脏肿大,表面布满肿瘤结节; D：图A肝脏肿瘤组织切片, 可见典型髓样细胞瘤; E：图B肝脏肿瘤组织切片, 可见典型髓样细胞瘤; F：图C肝脏肿瘤组织切片, 可见典型髓样细胞瘤A: The needle-shaped tumor nodules were distributed in the enlarged liver of died Laiwu Black chickens; B: The needle-shaped tumor nodules were distributed in the enlarged liver of Wenshang Barred chickens; C: The needle-shaped tumor nodules were distributed in the enlarged liver of Jining Bairi chickens; D: The histologic section of liver collected from chickens in Fig. A, and typical myeloma cells could be detected; E: The histologic section of liver collected from chickens in Fig. B, and typical myeloma cells could be detected; F: The histologic section of liver collected from chickens in Fig. C, and typical myeloma cells could be detected

2.4 NX0101感染对不同地方品系鸡免疫功能的影响如表5所示，静脉接种和卵黄囊接种两种感染方式均造成了感染鸡的免疫器官指数下降，NX0101感染组与空白对照组之间相比均差异具有显著统计学意义（P<0.05），但两种不同接种方式对某个特定品系鸡免疫器官指数的影响有所差别。对汶上芦花鸡和济宁百日鸡而言，静脉接毒对免疫器官发育的抑制程度要强于卵黄囊接毒；而对莱芜黑鸡而言，卵黄囊接毒对免疫器官发育的抑制程度则更强。不同地方品系鸡感染NX0101后，同时免疫NDV和AIV-H9灭活油乳疫苗，在免疫后3、4、5周采血检测NDV和AIV-H9抗体效价。血凝抑制抗体检测结果表明，两种途径感染ALV后都能显著抑制感染鸡对NDV和AIV-H9疫苗所诱发的HI抗体滴度，与本品系对照组相比差异具有显著统计学意义（P<0.05），但是在3个不同品系鸡之间差异不具有统计学意义（表6）。这表明不同品系鸡对鸡体引起的免疫抑制并没有明显差异。

表5 NX0101感染对不同品系鸡胸腺、法氏囊指数的影响Table 5 Inhibitory effect of NX0101 infection on chicken thymus and bursa of fabricius indexes

表6 NX0101感染对不同品系鸡NDV和AIV-H9抗体产生的影响Table 6 Inhibitory effect of NX0101 infection on NDV and AIV-H9 antibodies

3 讨论

目前，国外关于ALV遗传抗性的研究已有报道，不同品系鸡由于具有不同的遗传基础，因而对ALV的易感性差异很大。我国是世界上畜禽资源最丰富的国家之一，许多优良地方品种具有国外家禽品种所不及的优良性状，这些优良性状是育种的宝贵素材[22]。我们有必要充分利用我国地方品系鸡资源，发现抗病力较强的品系，筛选与ALV抗性相关的基因，从而为抗ALV新品系的培育奠定坚实基础。本实验室前期进行了初步研究，观察了白羽肉鸡、尼克蛋鸡和来航鸡等不同遗传背景的鸡对不同亚群不同毒株ALV的易感性[18]。本研究通过记录比较不同指标，进一步探究了3种不同地方品系鸡对ALV-J中国分离株NX0101株的易感性和抵抗力。ALV-J对鸡致病作用中，首先引起关注的是死亡率和肿瘤发病率。然而，对大多数品系鸡而言，ALV-J感染导致的肿瘤发生率都比较低[19]。因此，为了更清晰地展示不同品系鸡对ALV-J易感性的差异，我们采用了卵黄囊接种和静脉接种两种方式感染鸡胚，最大限度模拟垂直感染对雏鸡造成的致病作用。结果表明，在我们选取的3种地方品系鸡中，莱芜黑鸡由于病毒感染造成的死亡率和肿瘤发生率显著低于另外两个品系，而济宁百日鸡由于病毒感染所造成的死亡率和肿瘤发生率最高。

除了可以诱发感染鸡的肿瘤疾病外，ALV-J还可以引起生长迟缓、免疫抑制、产蛋量下降等亚临床症状[20,21]。因此，在本研究中，我们不仅观察记录了不同品系鸡感染NX0101株后的死亡率和肿瘤发生率，还分析了感染鸡的病毒血症及特异性抗体动态、体重增重、免疫器官指数、对疫苗的抗体反应等多项指标，来评价不同地方品系鸡对NX0101株的易感性和抵抗力。3种不同品系鸡从孵出后1w开始全部表现出持续性的病毒血症，但却始终没有出现抗体反应，表现了非常典型的免疫耐受性感染。因此，仅仅根据病毒血症和抗体反应无法判断鸡对ALV-J感染的抵抗力。免疫器官指数和对灭活疫苗免疫后的抗体反应动态显示，NX0101对不同品系鸡均具有显著的免疫抑制作用，但是这种作用在不同品系鸡之间差异也不具有统计学意义。有趣的是，我们发现，NX0101对3种品系鸡的体重增重均具有抑制作用，这种抑制作用在第4周时达到高峰，但病毒感染对莱芜黑鸡体重增重的影响显著低于另外两个品系。综合上述数据，我们认为莱芜黑鸡对NX0101的抵抗力最强，该品系鸡可以作为候选品系。以进行相关遗传抗性基因的筛选和遗传抗性机制的研究。

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COMPARISION OF SUSCEPTIBILITY OF DIFFERENT CHINESE INDIGENOUS CHICKEN BREEDS TO SUBGROUP J AVIAN LEUKOSIS NX0101 STRAIN

LUAN Huai-biao, WANG Yi-xin, XU Shu-zhen, FANG Li-chun, CUI Zhi-zhong, CHANG Shuang, ZHAO Peng

(College of Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Taian 271000, China)

To investigate the susceptibility and resistance of different Chinese indigenous chickens to subgroup J Avian leukosis virus (ALV-J) infection, three breeds (Laiwu Black, Wenshang Barred and Jining Bairi) were inoculated with ALV-J Chinese isolate NX0101 strain via intravenous and yolk sac routes. Several parameters including viremia, antibody response to viral infection and chicken growth were observed and analyzed. Results demonstrated that NX0101 infection of three different indigenous chicken breeds developed myelocytoma and showed subclinical traits, such as growth retardation and immunosuppression. However, pathogenicity of NX0101 varied greatly in different breeds. The mortality and tumor incidence of Laiwu Black chickens infected with NX0101 through intravenous or yolk sac were signif cantly lower than those of other breeds. In addition, the inhibition ratio of weight growth of Laiwu Black was the lowest in three breeds. Therefore, Laiwu Black chickens would be used as the candidate line to screen genetic resistance genes for ALV-J and further investigate genetic mechanism.

Subgroup J Avian leukosis virus(ALV-J); indigenous breed; susceptibility; genetic resistance

S852.659.3

A

1674-6422（2017）03-0040-06

2016-03-10

公益性行业（农业）科研专项经费项目（201203055）

栾怀彪，男，硕士，主要从事分子病毒学的研究；王一新，男，博士，主要从事分子病毒学的研究

赵鹏，E-mail： zhaopeng@sdau.edu.cn