奶粉中分离志贺氏菌和沙门氏菌能力验证结果分析

王珍++陆雯++王攀峰++吴岳琴++章舒祺

摘 要：为提高实验室对食品中志贺氏菌和沙门氏菌的检测能力，减少漏检或误检的机率，本实验室参加省级能力验证活动。按照GB4789《食品微生物学检验》和SN/T1869-2007《食品中多种致病菌快速检测方法 PCR法》标准进行。结果H-37、S-37奶粉样品中分别检出志贺氏菌、沙门氏菌，H-38及S-38奶粉样品中未检出致病菌，与公布的答案一致。通过能力验证，对关键步骤进行分析，积累沙门氏菌和志贺氏菌的检测经验。

关键词：能力验证；志贺氏菌；沙门氏菌；奶粉；PCR

中图分类号：Q93-3 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2017）12-0241-02

食品是人类赖以生存和发展的基础，随着人们生活水平的提高，食品安全问题备受关注。导致大部分食物中毒事件发生的主要因素是微生物。志贺氏菌和沙门氏菌是常见病原菌。沙门氏菌作为肠杆菌科中最主要的食源性致病菌，我国每年约有3亿人因其患病，占病原菌食源性疾病总致病的70%～80%[1]。人体感染沙门氏菌会导致胃肠炎、伤寒、副伤寒和败血症等严重疾病[2]，严重危害人民身体健康。因志贺氏菌是一个古老的菌属，仅有4个血清群和32个血清型，有些肠道菌株分解糖类仅产微量气体，加上抗原交叉凝集现象，很容易误报为志贺氏菌[3，4]。而实验室人员本身的检测能力和经验不足是导致在食品微生物常规检测中出现漏检或误判的可能[4]。为了降低这两种食源性疾病对民众健康带来的隐患，加强实验室的能力建设，提高实验室检测员的检测水平，本实验室参加了2016年省级食品安全检验机构能力比对活动，本文就结合传统方法与PCR方法，以此次从奶粉中分离志贺氏菌和沙门氏菌的实验步骤、相关经验和读者共同分享，以期为大家以后的以奶粉为基质的能力验证实验提供参考。

1 检测项目和要求

样品4份，检测参数为志贺氏菌、沙门氏菌，按国家标准检验方法进行，鉴定方法结合PCR方法。

2 材料和方法

2.1 待测样品

盲样4瓶，以脱脂奶粉为基质，添加目标菌制作而成的固体粉末。每瓶35g，样品编号分别为奶粉样品H-37、H-38和S-37、S-38，其中样品H-37、H-38检测参数为志贺氏菌，样品S-37、S-38检测参数为沙门氏菌。

2.2 材料与试剂

培养基及试剂：志贺氏菌增菌肉汤、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐（XLD）、麦康凯（MAC）琼脂、志贺氏菌显色培养基、缓冲蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、亚硫酸铋（BS）琼脂、沙门显色培养基、三糖铁（TSI）琼脂、志贺氏菌和沙门氏菌鉴定生化试剂等，购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，沙门氏菌A-F多价O血清、四价志贺氏菌血清，购自宁波天润生物药业有限公司，广谱DNA提取试剂盒（TAKARA）、PCR反应试剂（TAKARA），购自宝生物工程有限公司。

标准菌株：福氏志贺氏菌（编号CMCC（B）51572）、鼠伤寒沙门氏菌（编号CMCC（B）50115），购自南京便诊生物技术有限公司。

仪器设备：生物安全柜HFSafe-1500LC、生化培养箱LRH-250F、核酸蛋白定量分析仪Nano-100、PCR仪T100、凝胶成像仪JS-680D。

2.3 操作步骤

2.3.1 样品前处理

分别从4瓶盲样中称取25g至无菌均质袋内并标记H-37、H-38和S-37、S-38。

2.3.2 增菌

增菌操作分别按照GB 4789.5-2012《志贺氏菌检验》[5]及GB 4789.4-2012《沙门氏菌检验》[6]进行。

2.3.3 分离划线

用接种环取H-37、H-38增菌液各1环，划线接种于XLD、MAC琼脂、志贺氏菌显色培养基平板，36℃培养24-48h。取S-37、S-38增菌液各1环，划线接种于BS、XLD和沙门氏菌显色培养基平板，36℃培养24-48h。

2.3.4 生化鉴定

分别挑取可疑志贺氏菌菌落和可疑沙門氏菌菌落转接TSI和营养琼脂斜面进行纯化培养，挑取单菌落分别接种于一系列志贺氏菌生化试剂管及沙门氏菌生化试剂管内，依照生化试剂说明培养。

2.3.5 血清凝集

挑取生化鉴定典型的菌落，分别进行志贺氏菌和沙门氏菌血清凝集试验。步骤同GB4789《食品微生物学检验》[5，6]。

2.3.6 PCR试验

（1）DNA的提取。取增菌液1mL，用广谱DNA提取试剂盒进行DNA提取，操作步骤参考试剂盒内说明书。（2）PCR引物的设计。分别根据沙门氏菌靶基因invA、志贺氏菌靶基因ipaH设计特异性引物[7]，由上海生工合成，沙门氏菌引物序列：5-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3，5-TCATCGCACCGTCAAA GGAACC-3，扩增片段长度284 bp，质贺氏菌引物序列：5-GTTCCTTGACCGCCTCGATACCGTC-3，5-GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC-3，扩增片段长度629 bp。（3）PCR反应体系及反应条件。PCR反应体系为20μL，10xBuffer：2μL，dNTPs：1.6μL，正向引物：0.6μL，反向引物：0.6μL，Taq-酶：1μL，ddH2O 12.2μL，模板DNA：2μL。沙门氏菌、志贺氏菌退火温度分别为64℃、65℃，35个循环。

3 结果与分析

3.1 增菌分离结果

结果分别见表1、表2和表3。

3.2 生化鉴定

生化试验结果分别见表4和表5，根据生化试验初步判定S-37为沙门氏菌属，H-37为可疑的志贺氏菌属。

3.3 血清试验

血清凝集反应，H-37被志贺4价血清凝集，S-37被沙门A-F多价O血清凝集且生理盐水对照均未出现自凝现象，进一步判定S-37为沙门氏菌，H-37为志贺氏菌。

3.4 PCR结果

PCR结果见图1，其中S-37与H-37可见阳性条带，S-38与H-38未见条带，说明S-37与H-37分别为沙门氏菌可疑阳性，志贺氏菌可疑阳性，而S-38与H-38均未检出。

M：DL1000Marker；1-2：沙门氏菌S-37；3-4：沙门氏菌S-38；5-6：沙门氏菌阳性对照；7，14：沙门氏菌阴性对照和志贺氏菌阳性对照；8-9：志贺氏菌H-37、10-11：志贺氏菌H-38；12-13：志贺氏菌阳性对照。

4 结论

经生化、血清及PCR试验，判定样品H-37、S-37分别检出志贺氏菌、沙门氏菌；样品H-38、S-38未检出。与所公布的答案相符。

5 讨论

（1）样品收到后应检查密封状况，检验须及时，若不能立即检测，按说明书放置在2-8℃冷藏。非定量型的样品，建议留样。（2）严格控制增菌时间，并注意现象观察。若增菌时间过短，目标菌生长繁殖较少，一旦干扰菌占优势，在选择性平板上的目标菌将被覆盖导致漏检，同时应避免增菌时间过长杂菌增多造成干扰。（3）在MAC平板上，志贺氏菌菌落直径是辨别的关键，可借助量尺辅助确认。培养基同时用不同厂家的有助于典型菌落的识别[8]。（4）因志贺氏菌属与埃希氏菌属的O抗原关系非常密切，可能存在血清交叉凝集现象，因此，必须根据生化反应并结合血清结果作出判定[9]。（5）PCR试验应分区或分室进行，避免交叉污染和气溶胶污染。

参考文献

[1]Organization W H. Overcoming antimicrobial resistance.[J]. American Heart Journal，2000， 26（12）：283.

[2]王毳，闫磊，曾慶祝.沙门氏菌的检测技术与方法[J].现代食品科技，2007，23（5）：82-85.

[3]唐建民，何晓砚，赵重生.如何正确鉴定志贺氏菌属[J].中国卫生检验杂志，1993（6）：372-373.

[4]潘跃顺，赵克义，李景学.志贺氏菌实验室检测的漏检和误诊因素分析[J].中国公共卫生，2001，17（6）：569-571.

[5]中华人民共和国卫生部.GB 4789.5-2012食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验[S].北京：中国标准出版社，2012.

[6]中华人民共和国卫生部.GB 4789.4-2010食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验[S].北京：中国标准出版社，2010.

[7]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.SN/T 1869-2007食品中多种致病菌快速检测方法PCR法[S].北京：中国标准出版社，2007.

[8]刘继倩，宋驰萍，骆玲飞，等.两种培养基在健康人群中沙门菌检测的比较[J].中国实用医药，2011，06（31）：275-276.

[9]刘蔚，赵树红，杨淑其，等.正确鉴定志贺氏菌属[J].实用预防医学，1999（1）.