模拟应用条件检测小反刍兽疫活疫苗的病毒含量

苗书魁，米晓云，陆桂丽，夏俊，魏玉荣，魏婕，王延，马文戈，汪萍*，黄炯*

（1.新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心），新疆 乌鲁木齐 830011；2.天康生物股份有限公司，新疆 乌鲁木齐 830030）

兽医科学

模拟应用条件检测小反刍兽疫活疫苗的病毒含量

苗书魁1，米晓云1，陆桂丽1，夏俊1，魏玉荣1，魏婕1，王延1，马文戈1，汪萍1*，黄炯1*

（1.新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心），新疆 乌鲁木齐 830011；2.天康生物股份有限公司，新疆 乌鲁木齐 830030）

10.16863/j.cnki.1003-6377.2017.04.011

为确保小反刍兽疫活疫苗在免疫接种时的效果。本试验模拟野外操作环境，在不同稀释液、不同温度和不同放置时间条件下，检测并比较小反刍兽疫活疫苗病毒含量。结果表明，以PBS、含1%冷水鱼明胶的生理盐水、生理盐水分别稀释疫苗，1%冷水鱼明胶的生理盐水更适合作为小反刍兽疫活疫苗的稀释液。疫苗以三种不同的稀释液稀释后，在4 h内，25℃或37℃条件下，不会影响其效价。

模拟应用条件；检测；小反刍兽疫活疫苗；病毒含量

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的一种严重的烈性、接触性传染病，特征为发热、口腔及舌黏膜糜烂、流泪、流鼻涕、腹泻和肺炎[1]。PPRV感染可导致绵羊和山羊高达100%的发病率和显著的死亡率[2]，严重威胁着畜牧业的发展。自1942年PPR首次暴发于科特迪瓦以来，主要在东非、西非、中非、阿拉伯半岛和南亚等地流行[3-5]。2007年7月，我国西藏阿里地区首次发现自印度传入的PPR，至2014年9月，全国共有22个省(自治区)256个县先后发生PPR疫情[6-10]，造成巨大的经济损失。全球计划到2030年消灭小反刍兽疫[1，11]。我国农业部发布了《全国小反刍兽疫消灭计划(2016-2020年)》，计划到2020年，力争全国达到小反刍兽疫非免疫无疫区标准。

PPR是我国强制免疫的动物疫病，目前仍然靠疫苗免疫来预防。PPRV对温度比较敏感，37℃时，感染力的半衰期为1～3 h。目前小反刍兽疫活疫苗的规格有50头份和100头份。基层单位在使用过程中对疫苗稀释后一段时间内病毒含量能否达到说明书中合格的效价（大于103.0 TCID50）存在疑问，本试验通过模拟使用环境中温度和时间，对PPR活疫苗病毒含量进行了检测，以期为小反刍兽疫活疫苗的免疫预防工作提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 供试疫苗及细胞

PPR活疫苗2015001、2015002批，均由天康生物股份有限公司生产。Vero细胞由本实验室保存。

1.2 主要试剂

MEM/EBSS培养液、特级胎牛血清购自HyClone公司，冷水鱼明胶购自北京梅科万德生物科技有限公司。PBS（0.01 M，pH7.2）、生理盐水由本实验室自配。

1.3 方法

1.3.1 不同稀释液、不同温度、不同放置时间对病毒含量的影响

将2批疫苗用PBS（0.01 M，pH 7.2）、1%冷水鱼明胶的生理盐水、生理盐水三种稀释液按疫苗规定头份将疫苗稀释，在不同温度（25℃、37℃）、不同放置时间（0 h、1 h、2 h、3 h、4 h）的条件下测定病毒含量（TCID50）。

1.3.2 TCID50测定

用无血清MEM将小反刍兽疫活疫苗按瓶签注明头份稀释成1mL/头份，再进行10倍系列稀释，取10-1、10-2、10-3、10-44个稀释度，接种96孔细胞培养板，每个稀释度接种8孔，每孔0.1 mL，每孔再加入浓度为2～3×105个/mL的Vero细胞悬液0.1 mL。同时设立正常细胞对照，置37℃、5%CO2中培养6 d，根据出现细胞病变（CPE）的孔数，按Karber法计算TCID50。

2 结果与分析

2.1 PBS稀释疫苗后对病毒含量的变化

用PBS稀释疫苗，TCID50测定结果见表1。

表1 PBS稀释疫苗后病毒含量（TCID50/0.1 mL）

由表1可知，2批疫苗在25℃或37℃条件下，0～4 h内，病毒含量范围为103.375～103.625，病毒含量相差不大。2批疫苗在25℃或37℃下，随着放置时间的延长，病毒含量变化不大。2批疫苗在相同时间、25℃或37℃条件下，病毒含量接近。结果表明，2批疫苗病毒含量稳定，符合说明书中规定的效价。

2.2 1%冷水鱼明胶的生理盐水稀释疫苗后对病毒含量的变化

用1%冷水鱼明胶的生理盐水稀释疫苗，TCID50测定结果见表2。

表2 1%冷水鱼明胶的生理盐水稀释疫苗后病毒含量（TCID50/0.1 mL）

由表2可知，2批疫苗在25℃或37℃、0～4 h内病毒含量范围为103.5～103.625。表明2批疫苗病毒含量几乎没有变化。2批疫苗在25℃或37℃下，随着放置时间的延长，病毒含量几乎没有变化。2批疫苗在相同时间、25℃或37℃条件下，病毒含量接近。

2.3 生理盐水稀释疫苗后病毒含量的变化

用生理盐水稀释疫苗，TCID50测定结果见表3。

表3 生理盐水稀释疫苗后的病毒含量（TCID50/0.1 mL）

由表3可知，2批疫苗在25℃或37℃、0～4 h内病毒含量范围为103.25～103.625。2批疫苗在25℃或37℃下，随着放置时间的延长，病毒含量逐渐降低，从0 h的103.625降到4 h的103.25。2批疫苗在相同时间、25℃或37℃条件下，病毒含量接近。

3 讨论

经对天康生物股份有限公司生产的2批次的PPR活疫苗以三种稀释液分别稀释，检测其在不同条件下的TCID50并进行比较。结果表明：疫苗稀释后在25℃或37℃、0～4 h内病毒含量差别不大；PBS稀释疫苗后病毒含量范围为103.375～103.625；1%冷水鱼明胶的生理盐水稀释疫苗后病毒含量范围为103.5～103.625；生理盐水稀释疫苗后病毒含量范围为103.25～103.625。三种稀释液分别稀释疫苗后在25℃或37℃条件下放置0～4 h，病毒含量有所变化，但均符合说明书中规定的效价。因此，为了防止疫苗病毒含量降低，应优先选用1%冷水鱼明胶的生理盐水作为稀释液，如果免疫时没有该稀释液或配置不方便，可用PBS或生理盐水代替，也可取得理想的结果。综上所述，根据本试验结果，基层单位在免疫时，应优先选用1%冷水鱼明胶的生理盐水作为稀释液，疫苗稀释后，在25℃或37℃条件下，应于4 h内完成免疫接种为宜。

PPR活疫苗病毒含量受多种因素（如保存时间、保存温度、保护剂、稀释液种类和pH值等）影响会降低。免疫接种时，为了保证疫苗质量的有效性和稳定性，疫苗稀释后应尽快使用。此外，也可采用其它保护措施，如全程冷链运输、疫苗冻干过程中加入耐热保护剂、选用合适的稀释液、接种时避免环境温度过高等。

本文通过一系列试验，在不同稀释液、不同温度和不同放置时间的条件下，检测并比较了2批PPR活疫苗的病毒含量，为免疫接种时疫苗的使用提供指导。

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Detection of Virus Content in Peste des Petits Ruminants Live Vaccine with Simulated Application Conditions

MIAO Shu-kui1,MI Xiao-yun1,LU Gui-li1,XIA Jun1,WEI Yu-rong1,WEI Jie1,WANG Yan2, MA Wen-ge1,WANG Ping1*,HUANG Jiong1*
（1.Institute of Veterinary Medicine（Research Center of Animal Clinical）, Xinjiang Acadamy of Animal Science,Urumqi 830011，China; 2.Tecon Biology Co.Ltd,Urumqi 830030,China）

To ensure the efficacy of PPR(Peste des petits ruminants,PPR)live vaccine in immunization,the virus content was detected and compared in PPR live vaccine at different dilution,temperature and time under the condition of practical application.The results showed that the normal saline contains 1%gelatin from cold water fish is more suitable for dilution of PPR vaccine after the dilution of the vaccine with PBS, normal saline contains 1%gelatin from cold water fish and normal saline.The immune effect of PPR live vaccine did not affected significantly by different dilution and temperature 25℃or 37℃within 4 h.

Simulated application condition;Detection;Peste-des-petits ruminants live vaccine;Virus content

S852.23

A

1003-6377（2017）04-0056-04

国家科技支撑计划项目（2013BAD12B04）

苗书魁（1983-），男，助理研究员，理学硕士，从事动物病毒分子生物学研究。E-mail：miaoshukui123@sina.com

汪萍（1979-），女，助理研究员，从事动物疫病防控研究。E-mail：56307246@qq.com黄炯（1963-），男，研究员，从事重大动物疫病研究及生物制品开发。E-mail：jh124@163.com

2017-05-13，

2017-05-15